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Thesis

Influence of nanomaterials on cell function

MPS-Authors
http://pubman.mpdl.mpg.de/cone/persons/resource/persons76197

Tian,  F.
Former Dept. Theory of Mesoscopic Phenomena, Max Planck Institute for Intelligent Systems, Max Planck Society;
Dept. New Materials and Biosystems, Max Planck Institute for Intelligent Systems, Max Planck Society;

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Supplementary Material (public)
There is no public supplementary material available
Citation

Tian, F. (2006). Influence of nanomaterials on cell function. PhD Thesis, Universität Stuttgart, Stuttgart.


Cite as: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-4652-C
Abstract
The intention of this work was the study of mechanisms of interactions between nanomaterials and cells. The experiments carried out during this thesis focused on two kinds of nanomaterials: single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and nanostructured hydrogels. Chapter 1 provides a general introduction to the field of nanomaterials such as SWCNTs and nanostructured hydrogels. In chapter 2, the effects of SWCNTs on the polymerase chain reaction (PCR) are investigated via quantitative PCR product measurements using scanning electron microscopy (SEM), high-resolution transmission electron microscopy (HRTEM) and x-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The measurements show that adding SWCNTs to the reaction liquid increase the amount of PCR product at SWCNT concentrations below 3 µg/µl, but have a reversed effect at higher SWCNT concentrations. Similar results were obtained in PCR reactions with or without Mg2+ additive. Both SEM and HRTEM measurements show that the DNA templates and Taq enzymes are attached to bundles of SWCNTs in PCR products. XPS spectra show that the C 1s binding energy in PCR products increased after the reaction, because of the emergence of two new peaks beside the main peak, if compared with carbon nanotubes before the reaction. This suggests a chemical reaction between SWCNT and PCR components. SWCNTs may increase the PCR efficiency at a concentration range of less than 3 µg/µl in the reaction liquid and have the potential to act as catalysts in a variety of biochemical reactions. Chapter 3 shows a systematic study on human fibroblasts in the presence of refined CNTs with different geometries and sizes. The results were compared to other carbon materials. Particularly the cell survival has been studied with five kinds of carbon materials. In increasing order these are: i) SWCNT, ii) active carbon, iii) carbon black, iv) multiwall carbon nanotubes, and finally, v) carbon graphite. Interestingly, we found a strong size, time, and dose effect of carbon materials upon the cell survival. Furthermore, we found that a lower concentrations of SWCNTs than those reported in the literature induce death. Since carbon materials disturb cell membranes, and thereupon induce cells to detach from substrates, we measured the expression of cell adhesion related proteins, such as Laminin, Collagen-IV, Fibronectin, P-Cadherin and focal adhesion kinase. Finally, a biological mechanism that explains why smaller particles (e.g. SWCNT) have more influence is presented. In chapter 4, the influence of SWCNTs on human HEK293 cells is investigated with the aim of exploring SWCNTs biocompatibility. Results of dose and time dependent experiments show that SWCNTs can inhibit HEK293 cell proliferation and decrease the cell adhesive abilities. HEK293 cells exhibit active responses to SWCNTs such as secretion of several 20–30 kD proteins to wrap SWCNTs, aggregation of cells attached by SWCNTs and formation of nodular structures. Cell cycle analysis showed that 25 μg/ml SWCNTs induced G1 arrest and cell apoptosis in HEK293 cells. Biochip analysis showed that SWCNTs can induce up-regulation expression of cell cycle-associated genes such as p16, bax, p57, hrk, cdc42 and cdc37, down-regulation expression of cell cycle genes such as cdk2, cdk4, cdk6 and cyclin D3, and down-regulation expression of signal transduction associated genes such as mad2, jak1, ttk, pcdha9 and erk. Western blot analysis showed that SWCNTs can induce down-regulation expression of adhesion-associated proteins such as laminin, fibronectin, cadherin, FAK and collagen IV. These results suggest that down-regulation of G1-assoiciated cdks and cyclins and up-regulation of apoptosis-associated genes may contribute to SWCNTs induced G1 phase arrest and cell apoptosis. In conclusion, SWCNTs can inhibit HEK293 cell growth by inducing cell apoptosis and decreasing cellular adhesion abilities. In chapter 5 a new lithographic method is developed, employing a thiol linker to transfer nanostructures to soft materials. The particles form extended hexagonal patterns of Au-nanoparticles on hydrogel showing the same arrangement as nanopatterns on the glass slide. Further improvement in the preparation of hydrogel leads to the possibility of nanostructures transferring without losing the hexagonal order. Structural and density of nanostructured hydrogels is controlled by Au nanoparticle patterning on solid substrates. This method provides nano mask to control position and connect molecule (e.g. RGD) to the polymer surfaces. The nanosubstrates hydrogel are employed as cell adhesive templates, demonstrating the successful application of micellar nano- and soft lithography techniques to various research fields. For example, this application provides new way to study cell sense substrate deformation.
Das Ziel dieser Arbeit war es die Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen Nanomaterialien und Zellen zu untersuchen. Die Experimente, die im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführt wurden, galten insbesondere zwei verschiedenen Sorten von Nanomaterialien: einwandigen Kohlenstoffnanoröhren (engl. single-walled carbon nanotubes, SWCNT) und nanostrukturierten Hydrogelen. In Kapitel 1 wird eine allgemeine Einleitung über das wissenschaftliche Anwendungsfeld von Nanomaterialien wie SWCNTs und nanostrukturierten Hydrogelen gegeben. In Kapitel 2 wird der Einfluß von SWCNTs auf die Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) durch quantitative Bestimmung der PCR-Produkte mit Hilfe von Rasterelektronenmikroskopie, hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie und Röntgen-Photoelektronenspektroskopie untersucht. Die Messungen zeigen, daß die Zugabe von SWCNTs zur Reaktionslösung in Konzentrationen von weniger als 3 µg/µl zu einer Zunahme der PCR-Produkte führt, während höhere Konzentrationen zu einem umgekehrten Effekt führen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Zugabe von Mg2+-Additiven zur PCR-Reaktion erhalten. Sowohl SEM- als auch HRTEM-Messungen zeigen, daß die DNA-Template und Taq-Enzyme an SWCNT-Bündel in den PCR-Produkten gebunden sind. Vergleicht man die XPS-Spektren der Kohlenstoffnanoröhren von vor der Reaktion mit denen nach der Reaktion, so weisen die PCR-Produkte eine höhere C1s-Bindungsenergie auf, wie das Auftreten zweier neuer Signale neben dem Hauptpeak zeigt. Dies weist auf eine chemische Reaktion zwischen SWCNTs und PCR-Komponenten hin. Letztendlich können folglich SWCNTs in einem Konzentrationsbereich von unter 3 µg/µl in der Reaktionslösung die PCR-Effizienz erhöhen und haben das Potential in vielfältigen biochemischen Reaktionen als Katalysatoren zu dienen. In Kapitel 3 ist eine systematische Studie an menschlichen Fibroblasten in der Gegenwart von aufgereinigten CNTs verschiedener Geometrien und Größen dargestellt. Die Ergebnisse werden mit denen anderer Kohlenstoffmaterialien verglichen. Insbesondere wurde das Überleben der Zellen in Anwesenheit von fünf verschiedenen Kohlenstoffmaterialien untersucht. In der Reihenfolge zunehmender Ordnung sind dies: i) SWCNT, ii) Aktivkohle, iii) carbon black, iv) mehrwandige Kohlenstoffnanoröhren und v) Graphit. Interessanterweise wurde dabei eine starke Abhängigkeit des Zelltods von der Größe, Zeit und Dosis der Kohlenstoffverbindungen festgestellt. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß bereits Konzentrationen unter den in der Literatur dargestellten Werten zum Tod der Zellen führen können. Da Kohlenstoffverbindungen störend auf die Zellmembran wirken und deshalb zur Zellablösung vom Substrat führen können, wurde der Expression von Zellzyklus Adhäsion zusammenhängenden Proteine, wie Laminin, Collagen-IV, Fibronectin, P-Cadherin und focal adhesion Kinase gemessen. Zuletzt wird ein biologischer Mechanismus dargestellt, der erklärt warum kleinere Partikel, wie z.B. SWCNT, einen größeren Einfluß haben. In Kapitel 4 wird der Einfluß der SWCNTs auf menschliche HEK293-Zellen untersucht, um Aufschluss über die Biokompatibilität der SWCNTs zu gewinnen. Die Ergebnisse zeigen, daß SWCNTs die HEK293-Zellproliferation inhibieren können und die Adhäsionseigenschaften der Zellen abhängig von Zeit und Dosis schwächen. HEK293-Zellen zeigen aktive Reaktionen auf SWCNTs, wie die Absonderung verschiedener 20-30 kD schwerer Proteine, um die SWCNTs einzuschließen, von SWCNTs zusammengehaltene Aggregation von Zellen und die Bildung von knotenförmige Strukturen. Zellzyklus- Untersuchungen zeigten, dass eine Konzentration an SWCNTs von 25µg/ml im Zellmedium bei HEK293-Zellen einen G1 Arrest sowie Apoptose hervorrufen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Herabregulation von Vertretern der mit der G1- Phase assoziierten Genklassen cdk und cyclin sowie die Hochregulation von Apoptose assoziierten Genen zu dem auf SWCNTs zurückzuführenden G1- Phasen Arrest bzw. der Apoptose beitragen. In Kapitel 5 wird eine neue lithographische Methode entwickelt, die sich eines Thiol Ankers bedient, um Nanostrukturen auf weiche Materialien zu übertagen. Es werden dabei hexagonal geordnete Muster von Gold- Nanopartikeln großflächig auf Glasplättchen erzeugt und unter Beibehaltung der ursprünglichen Ordnung auf Hydrogele transferiert. Das Muster aus Goldpunkten stellt eine Nano- Maske dar, die es ermöglicht, auf der Polymer- Oberfläche an kontrolliert geordneten Positionen Moleküle (z.B. Peptide/Proteine) anzubinden. Die nanostrukturierten Hydrogele werden als Substrate für Zelladhäsionsversuche verwendet, womit die Anwendbarkeit der mizellären Nano- und Soft- Lithographie in diversen Forschungsbereichen gezeigt wird. Unter anderem ermöglicht dieses Verfahren zum Beispiel auf Grund der mechanischen Eigenschaften der generierten Substrate zu erforschen, wie bzw. inwieweit Zellen deformierbare Substrate wahrnehmen und darauf reagieren.