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Thesis

Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Replikationsdynamik von MVA in AGE1.CR.pIX-Zellen

MPS-Authors
http://pubman.mpdl.mpg.de/cone/persons/resource/persons101669

Blechert,  Anne-Kareen
Bioprocess Engineering, Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, Max Planck Society;

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Citation

Blechert, A.-K. (2011). Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Replikationsdynamik von MVA in AGE1.CR.pIX-Zellen. Master Thesis, Technische Universität, Braunschweig.


Cite as: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0013-8AF4-2
Abstract
Das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ist ein abgeschwächtes Virus, welches sich nicht in humanen Zellen replizieren kann. Deswegen war es in der Vergangenheit ein geeignetes Werkzeug zur Immunisierung gegen Pocken. Die große Wirtsspezifität des Virus hat zur Folge, dass eine Replikation vorwiegend in aviären Zellen, wie z.B. der durch ProBioGen AG in Kooperation mit IDT Biologika GmbH entwickelten Designerzelllinie AGE1.CR.pIX möglich ist. Aufgrund der genannten Eigenschaften dient MVA heutzutage als genetischer Vektor in der molekularbiologischen Forschung, aber auch weiterhin als Impfstoff gegen die Pockenkrankheit. Die Quantifizierung aktiver Viruspartikel ist ein entscheidendes Element bei der Untersuchung der Replikationsdynamik. Bisher konnte die Viruskonzentration ausschließlich über ein sehr kosten- und zeitintensives Verfahren (TCID50-Test) bestimmt werden. Ausgangspunkt und Fragestellung dieser Arbeit war u.a. die Annahme, dass die Messung der Fluoreszenz infizierter Zellen potentiell eine alternative Methode der Virustiterermittlung darstellt. Vor allem aber stand die zuverlässige Identifikation infizierter Zellen am Durchflusszytometer im Vordergrund. Zu diesem Zweck wurde für die Experimente das rekombinante MVA-egfp Virus eingesetzt. Die folgende Arbeit zeigt die Daten zur Infektion der AGE1.CR.pIX-Zellen mit MVA und dem rekombinanten MVA-Stamm (MVA-egfp). Hierbei erreichte das rekombinante Virus in den Zellen vergleichbare Titer zu denen des Wildtyps. Maximale Titer von 5,6*108 Viren/mL (MVA) und 3,2*108 Viren/mL (MVA-egfp) wurden ca. 50 Stunden nach der Infektion erreicht. In weiterführenden Infektionsstudien konnte zudem gezeigt werden, dass sowohl die multiplicity of infection (moi), die Medienzusammensetzung als auch das Kultivierungssystem selbst entscheidenden Einfluss auf die Virusproduktion hatte. Optimale Bedingungen für die MVA-Replikation waren demnach ein Medienverhältnis (CD-VP4 : CD-U2) von 1:1, eine moi von 0,05 und die Kultivierung in Schüttelkolbensystemen. Kultivierung im Rührkesselreaktor DasGip® lieferten einen Anteil infizierter Zellen von 43 %, DasGip® Dunkelkultivierungen 86 % und im Schüttelkolben konnten 52 % der Zellen infiziert werden. Zusätzlich wurden Virusproben unter dem Laser Scanning Mikroskop untersucht, um die Ergebnisse des Durchflusszytometers zu bestätigen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Infektionsstudien lassen AGE1.CR.pIX als robuste Produktionszelllinie für MVA erkennen. Allerdings lieferten die Ergebnisse der Titerbestimmungen mittels TCID50 und dem Durchflusszytometer keine statistische Korrelation. Zukünftig ist es daher unerlässlich, weiterführende Fluoreszenzmessungen durchzuführen, um so die Virusquantifizierung zu erleichtern und den analytischen Aufwand zu verringern. Zuverlässig konnte aber der Anteil infizierter Zellen an der Gesamtpopulation bestimmt werden. Eine Einbindung der erhobenen Daten in ein mathematisches Modell ist somit möglich und bildet die Grundlage für ein umfassenderes Verständnis von MVA Infektionen.