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Thesis

Kartierung des Zebrafischgenoms: Strategien und Anwendungen The zebrafish genome: Strategies and applications for physical and radiation hybrid mapping

MPS-Authors

Otto,  Georg Wilhelm
Max Planck Society;

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Citation

Otto, G. W. (2002). Kartierung des Zebrafischgenoms: Strategien und Anwendungen The zebrafish genome: Strategies and applications for physical and radiation hybrid mapping. PhD Thesis, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany.


Cite as: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-8BFA-7
Abstract
Der Zebrafisch ist ein wichtiger Modellorganismus für genetische, molekulare und embryologische Untersuchungen der Embryonalentwicklung. Obwohl immer mehr genomische Ressourcen zur Verfügung stehen (genetische Karten, Bestrahlungshybridkarten, genomische Bibliotheken, cDNA Bibliotheken), ist die Klonierung von Genen, die durch einer Mutante entdeckt wurden, schwierig und zeitaufwendig. Eine physikalische Karte des Genoms, die mit genetischen und Bestrahlungshybridkarten verankert ist, kann die Identifizierung und Klonierung mutierter Gene erleichtern und dient als Grundlage für die Sequenzierung des Genoms. Genkataloge mit Expressions- und Kartierungsdaten sind entscheidend für die Auswahl von Kandidatengenen und ermöglichen daher die Identifizierung mutierter Gene. Das Thema dieser Arbeit ist die Entwicklung und Anwendung der physikalischen Kartierung und Bestrahlungshybridkartierung im Zebrafisch. Die Arbeit gliedert sich in drei Teile: Im ersten Teil wird beschrieben, wie die auf eingestreute repetitive Elemente beruhende Polymerase-Kettenreaktion (IRS-PCR) an das Zebrafischgenom angepaßt und optimiert wurde, insbesondere für die physikalische und Bestrahlungshybridkartierung. Dazu wurden verschiedene repetitive Elemente, Primerbindestellen und PCR Bedingungen getestet. Ein neuer Zebrafischrepeat wurde gefunden und charakterisiert. Eine Markerbank aus IRS-PCR Produkten von fünf Zebrafischstämmen wurde konstruiert, und 27.000 Klone wurden gepickt. Diese Markerbanken wurden durch Oligunukleitid-Fingerprinting normalisiert, wodurch etwa 11.000 verschiedene Sequenzen identifiziert werden konnten. Dadurch wurden auch Produkte mit +/- Polymorphismus in den verschieden Stämmen identifiziert. IRS-PCR Produkte wurden durch Sequenzierung näher charakterisiert. Die Durchschnittsfrequenz von SNPs (single nucleotide polymorphisms) beträgt p = 0.013. Aus diesem Grund ist unsere normalisierte IRS-PCR Markerbank ein geeignetes repräsentatives Subset des Genoms für die SNP-Detektion. Die Kartierung von IRS-PCR Produkten mittels der Hybridisierung auf Bestrahlungshybride wurde ebenfalls entwickelt. Im zweiten Teil wurde eine physikalische Rahmenkarte der Kopplungsgruppe 20 des Zebrafischs erstellt. Ein Kartierungsverfahren wurde entwickelt, in dessen Verlauf kartierte Oligonukleotide auf eine PAC-Bibliothek und IRS-Marker auf YAC- und PAC-Pools hybridisiert wurden. Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden 344 Oligonukleotid- und 284 IRS Sonden verwendet. Insgesamt wurden 3416 PACs getroffen, die zur Zeit durch Restriktions-fingerprinting analysiert werden. Dadurch werden sie in die Tübinger Restriktionskarte integriert und ein Klonpfad für die genomische Sequenzierung wird konstruiert. Ein Teil der Hybridisierungsergebnisse wurde für die Konstruktion von Contigs verwendet. Dies umfaßte 388 Sonden, die 2007 Klone trafen, und damit eine Markerdichte von 1/205 kb repräsentieren. Das Contigassembly besteht aus 249 Contigs, von denen 19% durch mehr als eine Sonde verankert sind. Diese Daten stimmen mit der theoretischen Erwartung überein. Auf diese Weise wurde eine physikalische STS-Rahmenkarte des Chromosoms 20 des Zebrafischs erstellt, die mit den genetischen und Bestrahlungshybridkarten verankert und in die Restriktionsfingerprintkarte integriert ist. Dies ist die erste derartige Karte eines Zebrafischchromosoms. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Zebrafisch ESTs, die humanen Krankheitsgenen sequenzhomolog sind oder spezifische Expressionsmuster zeigen, auf der Bestahlungshybridkarte positioniert. Bis jetzt wurden > 120 Klone auf diese Weise kartiert. Ziel dieses Teils der Arbeit ist die Identifizierung von Kandidatengenen für Zebrafischmutationen und die verfeinerte Kartierung der Syntänieverhältnisse zwischen Mensch und Zebrafisch. Die Syntäniedaten dienen zur Bestimmung, ob es sich bei homologen Sequenzen von Mensch und Zebrafish um Orthologe oder Paraloge handelt.