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Abstract

Die Knochenentwicklung bei Vertebraten beginnt während der Embryonalentwicklung. Die meisten Knochen entstehen auf dem Weg der endochondralen Ossifikation. Hierbei kondensieren aus mesenchymalen Vorläuferzellen Chondrozyten. Diese proliferieren und differenzieren zu hypertrophen Chondrozyten, die schließlich durch Knochen ersetzt werden. Dieser Mechanismus der Knochenbildung findet postnatal bis zur Schließung der Wachstumsfuge statt und wird bei der Heilung von Knochenbrüchen reaktiviert. Ein wichtiger Signalfaktor, der sowohl die Differenzierung als auch die Proliferation und Knocheninduktion kontrolliert, ist der sekretierte Signalfaktor Indian-Hedgehog (Ihh). Frührere Studien haben gezeigt, daß die Kontrolle der Chondrozytendifferenzierung durch Ihh im Rahmen des Ihh/PTHrPRückkopplungs- kreises kontrolliert wird. Dabei reguliert Ihh durch die Induktion von Parathyroid Hormone related peptide (PTHrP) die Differenzierung von Chondrozyten zu hypertrophen Chondrozyten und ist proportional zur Menge der sich differenzierenden Chondrozyten exprimiert. Ziel dieser Arbeit war es, frühe Zielgene von Ihh zu identifizieren. Es konnte erstmals gezeigt werden, daß durch Cyclopamin eine Blockade des Ihh-Signalweges in der Kultur embryonaler Mausgliedmaßen erreicht wird. Diese Blockade führt zu einer ausbleibenden Induktion von PTHrP und einer verstärkten Differenzierung. Die Stimulation des Ihh-Signalweges wurde mit rekombinantem Shh-Protein erreicht. Auf dieser Grundlage wurde ein Screen nach Ihh-Zielgenen mit PCR-basierter subtraktiver Hybridisierung durchgeführt. Es wurden 60 Gene für die Aktivierung und 74 Gene für die Inhibition des Ihh-Signalweges gefunden. Von diesen 134 Klonen zeigten 32 ein chondrozytenspezifisches Expressionsmuster. Über die Transkriptquantifizierung dieser 32 Kandidaten mittels RNAse-Protection Assay konnten zwei Gene identifiziert werden, die in Antwort auf eine Inhibition des Ihh-Signalweges herabreguliert werden. Beide Gene werden von Ihh-defizienten Mäusen nicht exprimiert. Darüberhinaus zeigen Ihh-überexprimierende Mäuse eine Aktivierung der Expression dieser Gene in ihren Gliedmaßenanlagen. Eines der gefundenen Gene kodiert für Legumain, eine Cystein-Endopeptidase. Aufgrund des Expressionsmusters, das teilweise mit dem von Ihh überlappt, ist es möglich, daß Legumain ein negativer Regulator des Ihh-Signalweges ist. Weiterhin wird Legumain im Knochen exprimiert. Dies läßt auf eine unterstützende Rolle bei der Deposition der Knochenmatrix in dieser Region schließen. Das zweite Gen konnte einer neuen Genfamilie zugeordnet werden, die sich durch die computerannotierte Domäne unbekannter Funktion 590 (DUF 590) auszeichnet. Die Analyse der murinen EST-Datenbank ergab eine Transkriptsequenz von 5,9 kb mit einem offenen Leserahmen von 2727 Basen, entsprechend 909 Aminosäuren. Der Locus für dieses Gen konnte identifiziert werden. Er liegt auf dem Mauschromosom 15 in der Bande 15E3. Der Genlocus erstreckt sich über 185 kbp und umfaßt 20 Exons sowie ein alternatives Exon. In dieser Arbeit wurde ein neuer methodischer Ansatz zur effektiven Inhibition des Ihh-Signalweges etabliert. Die darauf aufbauende Identifikation von zwei neuen Zielgenen ist die Grundlage für ein tiefergehendes Verständnis des Ihh-Signalweges.