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Hochschulschrift

Anwendung von RNA-Interferenz zur spezifischen Hemmung der Genexpression in Knochenmarkstromazellen

MPG-Autoren

Szameit,  Sandra
Max Planck Society;

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Zitation

Szameit, S. (2004). Anwendung von RNA-Interferenz zur spezifischen Hemmung der Genexpression in Knochenmarkstromazellen. Diploma Thesis, Universitaet Bayreuth, Bayreuth.


Zitierlink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-88BC-9
Zusammenfassung
RNA-Interferenz ist ein Mechanismus der post- transkriptionellen Genexpressionshemmung durch dsRNA-Moleküle. Unter anderem dient er pflanzlichen und tierischen Organismen als Schutz gegen virale Infektionen und gegen die Destabilisierung ihres Genoms durch Transposons. Hierbei werden lange doppelsträngige RNAs zu kurzen, ebenfalls doppelsträngigen, „small interfering“ RNAs (siRNAs) prozessiert. Die siRNAs leiten durch Basenpaarung mit komplementärer mRNA deren Abbau ein. Seit der Entdeckung der RNAInterferenz nutzt man diesen Mechanismus, um die Expression von Genen gezielt zu hemmen. Hierzu werden dsRNAs oder siRNAs, die zu einem Sequenzbereich des zu unter- suchenden Gens komplementär sind, in Zellen eingebracht. Die Auswirkungen der Reduktion der entsprechenden mRNA-Menge können analysiert und so Rückschlüsse auf die jeweilige Genfunktion gezogen werden. Eine erfolgreiche Anwendung von RNAInterferenz zur Genexpressionshemmung in Knochenmark- stromazellen (KMSZ) wurde bisher nicht beschrieben. In dieser Arbeit wurde nach Auswahl eines geeigneten Serums zur Kultivierung von KMSZ eine Vielzahl von Bedingungen zur Transfektion und Elektroporation getestet, um chemisch synthetisierte siRNAs in diese Zellen einzubringen. Zur Überprüfung der Transfektions- bzw. Elektropora- tionseffizienz diente eine fluoreszenzmarkierte siRNA, deren Aufnahme in die Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen wurde. Auf diese Weise wurde ermittelt, dass die Anwendung des Transfektionsreagenz Lipofectamine 2000 am besten geeignet ist. Unter Verwendung von Lipofectamine 2000 konnte eine Transfektionseffizienz von nahezu 90% erreicht werden. Unter den ermittelten optimalen Transfektionsbedingungen wurde als nächstes eine RNA-Interferenz-induzierte Expressionshemmung spezifischer Gene in KMSZ untersucht. Verschiedene siRNAMoleküle, die komplementär zu der mRNA von Vinculin und Vimentin sind, wurden eingesetzt und eine Reduktion der jeweiligen mRNA und Proteinmengen durch Western-Blot und RT-PCR bestimmt. Schließlich wurde in dieser Arbeit die Genexpression des Transkriptionsfaktors Slug in KMSZ mittels RNA-Interferenz reduziert und Effekte auf die KMSZ-Morphologie und die Expression eines neuronalen Markers beurteilt. Während der Differenzierung mesenchymaler KMSZ in neuronenartige Zellen war in Vorarbeiten eine Abnahme der mRNA-Menge dieses Gens festgestellt worden. Da dem Transkriptionsfaktor Slug eine entscheidende Rolle bei dem umgekehrten Prozess, der Umwandlung epithelialer in mesenchymale Zellen, zugesprochen wird, wurde eine Beteiligung des Transkriptionsfaktors an der Regulation dieser Differenzierung vermutet. Aufgrund der angewandten Kriterien konnte keine spezifische Auswirkung der Reduktion der Slug-Genexpression festgestellt werden. Zusammenfassend wurde ein Protokoll zur Anwendung der RNA-Interferenz in KMSZ etabliert, welches eine schnelle Analyse von Genfunktionen ermöglicht.