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Thesis

Experimentelle Analyse von in silico Vorhersagen über die Genregulation durch Transkriptionsfaktoren

MPS-Authors

Meyer.,  Anne-Karen
Max Planck Society;

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Citation

Meyer., A.-K. (2004). Experimentelle Analyse von in silico Vorhersagen über die Genregulation durch Transkriptionsfaktoren. Diploma Thesis, Technische Universitaet Berlin, Berlin.


Cite as: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-87DE-5
Abstract
Ziel dieser Arbeit war die experimentelle Analyse von in silico Vorhersagen zur Genregulation durch Transkriptionsfaktoren. Für eine schnelle und einfache Analyse sollte mit dem Mechanismus RNA-Interferenz die Menge von jeweils einem Transkriptionsfaktor in HeLa-Zellen reduziert werden und anschliessend die Auswirkungen auf die Transkription der vorhergesagten Zielgene mit der Real-time-PCR quantifiziert werden. Zunächst wurde die Möglichkeit untersucht, den Knockdown eines Transkriptionsfaktors mit einem Short-hairpin-Expressionsplasmid durchzuführen. Es konnte dabei eine Knockdowneffizienz von 30-70% gezeigt werden, die jedoch zum Screenen nach unbekannten, funktionellen siRNAs zu gering war. Stattdessen wurden chemisch synthetisierte siRNAs für die weiteren Experimente verwendet Anhand von drei Transkriptionsfaktoren und jeweils sechs vorhergesagten Zielgenen sollte überprüft werden, ob eine experimentelle Analyse mit den Vorhersagen übereinstimmt oder zu welchem Teil sie zutrifft. Bei vier bis sechs von sechs vorhergesagten Zielgenen je Transkriptionsfaktor (insgesamt 15 von 18) konnte eine Korrelation nachgewiesen werden. Da auch 8 von 14 Negativkontrollen ohne Bindungsstellen für die untersuchten Transkriptionsfaktoren auf das Entziehen des Transkriptionsfaktors mittels RNAi mit einer veränderten Transkriptionsrate reagierten, wurde deutlich, dass die Real-time-PCR auch sekundäre Effekte aufzeichnet. Ein abweichender Phänotyp der mit siRNA behandelten Zellen konnte nicht festgestellt werden. Eine verringerte Proliferation der Zellen, denen der Transkriptionsfaktor PAX5 weitgehend entzogen wurde, konnte in einem BrdU-Puls-Experiment nicht bestätigt werden. Diese Art der Analyse hat Vorteile, wenn keine oder wenige Kenntnisse über die möglichen Zielgene vorhanden sind und mit Hilfe von bioinformatischen Vorhersagen eine Vorauswahl getroffen werden soll. Für den Nachweis der direkten Aktivierung oder Repression der Transkriptions eines Gens durch einen Transkriptionsfaktor müssen andere Methoden, wie z.B. Chromatinimmunopräzipitation zum Einsatz kommen.