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Thesis

Detektion einzelsträngiger DNA mit der Hilfe von DNAzymen

MPS-Authors

Hasselbach,  David
Max Planck Society;

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Fulltext (public)

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Citation

Hasselbach, D. (2008). Detektion einzelsträngiger DNA mit der Hilfe von DNAzymen. Bachelor Thesis, Universität Potsdam, Potsdam.


Cite as: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7F42-D
Abstract
In dieser Arbeit wurde eine katalytisch aktive einzelsträngige DNA (DNAzym), welche durch Bindung des Porphyrins Hemin eine Peroxidaseaktivität zeigt, auf ihre Anwendbarkeit für die Detektion ober ächengekoppelter einzelsträngiger Nukleinsäuren überprüft. Ein an eine Ober äche gekoppeltes DNA-Oligonukleotid sollte als Analyt dienen. In einem auf der rolling circle ampli cation (RCA) basierenden Assay sollte der Analyt kovalent mit einer Vielzahl an DNAzymen markiert werden und nach einer photometrischen bzw. luminometrischen Reaktion detektiert werden. Für die Etablierung des Assays wurden zuerst die Eigenschaften des DNAzyms untersucht. Zur Bestimmung der Aktivität des DNAzyms wurde der Umsatz von ABTS und Luminol mit H2O2 gemessen. Dabei ergaben beide Pu er die gleiche Sensitivität. Die Luminolmessung hatte einen stark eingschränkten Messbereich (1-50nM DNAzym), weshalb hauptsächlich mit dem ABTS als Substrat gearbeitet wurde. Mit dem Umsatz von ABTS konnten DNAzym-Konzentrationen von 1-1000nM detektiert werden konnten. Durch Aufnahme einer Michaelis-Menten-Kinetik wurde die Wechselzahl bezogen auf den ABTS-Umsatz von 0,631s bestimmt. Die Bindung des Hemins an das DNAzym wurde untersucht und die Dissoziationskonstante mit KD = 0; 58 0; 31 M (T=298K) bestimmt. Es wurde gezeigt, dass der Abstand zwischen zwei DNAzymen auf einem Strang mindestens 25 Nukleotide betragen sollte, damit sich beide ausbilden. Ein nicht immobilisierter Analyt sollte mit dem gewünschten Assay detektiert werden. Dies gelang mit nanomolaren Konzentrationen des Analyten. Dabei erhielt man einen stetigen Anstieg der Peroxidaseaktivität des DNAzyms bis zu einer RCA-Dauer von 40min. Eine Detektion eines an eine Ober äche gekoppelten Analyten war bisher nicht möglich. Eine Bindung und eine RCA-Reaktion an der Ober äche konnte zumindest in geringem Maÿe nachgewiesen werden, die Peroxidaseaktivität der entstandenen DNAzym-Sequenzen jedoch nicht.