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Thesis

Identifizierung funktioneller Intrabodies für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in SCA2.

MPS-Authors
http://pubman.mpdl.mpg.de/cone/persons/resource/persons50627

Weber,  Susanne
Dept. of Vertebrate Genomics (Head: Hans Lehrach), Max Planck Institute for Molecular Genetics, Max Planck Society;

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Citation

Weber, S. (in preparation). Identifizierung funktioneller Intrabodies für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in SCA2.


Cite as: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7D9A-E
Abstract
Die Spinozerebellare Ataxie Typ 2 ist eine neurodegenerative Erkrankung, die autosomal dominant vererbt wird. Sie gehört zur Familie der Polyglutaminerkrankungen, welche durch die Expansion von CAG-Wiederholungen in den krankheitsauslösenden Genen gekennzeichnet ist. Das SCA2 auslösende Gen kodiert für das Protein Ataxin-2, dessen biologische Funktion noch nicht vollständig verstanden ist. Die Mechanismen der Erkrankung konnten ebenfalls noch nicht geklärt werden. Für die Aufklärung der Funktion von Proteinen, sowie von Erkrankungsmechanismen besitzen intrazellulär exprimierte scFv-Fragmente, so genannte “Intrabodies”, ein hohes Potential. Daher war es Ziel dieser Arbeit im neuartigen “Intrabody” Screen Antikörperfragmente zu identifizieren, die die Interaktion verschiedener Regionen des Ataxin-2 Proteins mit PABC bzw. SH3GL3 unterbinden. Für die Interaktion von ATXN2(Q22)1-396 und SH3GL3, sowie ATXN2481-815 und SH3GL3 konnten im Rahmen der Arbeit potentiell inhibitorische Binder gefunden werden, für die Interaktion von ATXN2816-1312 und PABC hingegen nicht. Die Antikörperfragmente, die für den “Intrabody” Screen eingesetzt wurden, stammten aus Phagen-Display-Selektionsrunden gegen ATXN2816-1312 und SH3GL3. Aus diesen und weiteren Selektionsrunden wurden parallel monoklonale scFv-Fragmente für ATXN2816-1312, SH3GL3 und eGFP hergestellt. Diese wurden in ELISA und Western Immunoblot auf ihre Antigenbindung untersucht. Im ELISA konnten für alle Targets Binder identifiziert werden. Die Antigenbindung der scFv-Fragmente war im Western Immunoblot jedoch nicht nachweisbar. Die Expression und Kolokalisation der anti-ATXN2816-1312 scFv-Fragmente mit Ataxin-2 wurde im Anschluss in Säugerzelllinien untersucht. Als Kontrolle dienten im ELISA identifizierte anti-eGFP-Binder. Alle scFv-Fragmente ließen sich in den Säugerzellen exprimieren. Eine mögliche Interaktion der anti-ATXN2816-1312“Intrabodies” mit endogenem Ataxin-2 konnte jedoch anhand der mikroskopischen Aufnahmen weder eindeutig bestimmt, noch ausgeschlossen werden.