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Hochschulschrift

Funktionelle Analyse von in der Skelettentwicklung differentiell regulierten Genen

MPG-Autoren

Wilkening,  Ulrich
Max Planck Society;

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Zitation

Wilkening, U. (2009). Funktionelle Analyse von in der Skelettentwicklung differentiell regulierten Genen. PhD Thesis, Freie Universität, Berlin.


Zitierlink: https://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7D97-3
Zusammenfassung
Zusammenfassung: Die Skelettentwicklung unterliegt komplexen regulatorischen Mechanismen und viele Krankheiten sind mit Mutationen in den Genen, die zu diesem Prozess beitragen, assoziiert. Bis heute ist das gesamte Netzwerk an Faktoren, die in diese Vorgänge involviert sind, noch nicht vollständig aufgeklärt. Deswegen lag der Fokus dieser Arbeit auf der Identifikation von neuen Genen mit einer relevanten Funktion für die Skelettentwicklung. Die Expression des Transkriptionsfaktors Mef2c war in embryonalen Humeri von Runx2-/- Mäusen reduziert [Hecht et al., 2007]. Expressionsanalysen zeigten mRNA Transkript von Mef2c im Perichondrium, den prähypertrophen und hypertrophen Chondrozyten von Humeri zum embryonalen Stadium E15,5. Dies ließ eine Rolle von Mef2c in der Skelettentwicklung vermuten. Funktionelle Untersuchungen in vitro in mesenchymalen Hühnerzellen, die eine osteoblastische Differenzierung durchliefen und in Hühner Micromass Kulturen zeiten, daß eine retrovirale Überexpression von Mef2c die Transkriptmenge der Differenzierungsmarker Col10a1, Ibsp, Akp2, Ihh und Pthr1 erhöhte. Die Cre/lox vermittelte Deletion von Mef2c im Gliedmaßenmesenchym und in Chondrozyten führte zu einem kurzgliedrigen Phänotyp mit einer Verzögerung der hypertrophen Differenzierung und enchondralen Ossifikation. Histologische Untersuchungen der mutanten Knochen zeigten eine signifikante Verbreiterung und gestörte Orientierung der Wachstumsfugen plus eine auffällige Verdickung des kortikalen Knochens. Diese Merkmale ähnelten denen bei metaphysären Chondrodysplasien des Menschen – speziell vom Typ Jansen (JMC). Dies implizierte eine Fehlregulation der Ihh/PTHrP Signalschleife, da eine Hyperaktivierung des PTH/PTHrP-Rezeptors bei der JMC nachgewiesen wurde. Zusätzlich erschienen in den Knochen der Mef2cloxP/KO Mäuse die Expressionsmuster von Col10a1, Ihh, Pthr1 und Runx2 gestört und in ihrer Stärke reduziert. Die Analyse regulatorischer Regionen in den Promotoren der Gene, die durch eine in vitro Überexpression von Mef2c stimuliert wurden, enthüllte mögliche Mef2c Konsensussequenzen in den Promotoren von Col10a1, Ihh, Ocn und Pthr1. In Reporterassays war Mef2c der stärkste Aktivator von Col10a1 Reporterkonstrukten, während Pthr1 Reporterkonstrukte synergistisch durch Mef2c, Runx2 und Sp1 aktiviert wurden. Im Gegensatz dazu zeigte Mef2c einen inhibitorischen Effekt auf die Runx2 vermittelte Aktivierung eines Ocn Reporters. PTH/PTHrP Signale sind bekannte Inhibitoren für die Expression von Col10a1 – in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sie auch die p38 abhängige Phosphorylierung von Mef2c in Chondrozyten reduzierten. Mutationen unterschiedlicher Posphorylierungsstellen im Mef2c konnten jedoch die Regulation des Col10a1 Promotors durch PTHrP und p38 nicht aufheben. Interessanterweise führte ein Verlust der p38 und Erk5 spezifischen Phosphorylierungsstelle an Position S387 zu einer erhöhten Aktivierbarkeit des Mef2c durch p38. Damit wird die p38 abhängige Phosphorylierung von Mef2c durch PTHrP reguliert, aber sie übt nur eine modulierende Rolle aus. Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß Mef2c eine wichtige Rolle in der enchondralen Ossifikation spielt und erlauben eine Positionierung von Mef2c innerhalb der Ihh/PTHrP Signalschleife mit einer potentiellen Rolle bei der Regulation der Runx2 Expression und Funktion.