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Hochschulschrift

Die Optimierung der Aptamerselektion gegen kleine Moleküle

MPG-Autoren

Blank,  Kristina
Max Planck Society;

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Zitation

Blank, K. (2010). Die Optimierung der Aptamerselektion gegen kleine Moleküle. Diploma Thesis, Freie Universität Berlin, Berlin.


Zitierlink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7AA3-0
Zusammenfassung
Zusammenfassung Das Ziel dieser Arbeit war die Optimierung des SELEX- Verfahrens gegen kleine Moleküle. SELEX steht dabei für Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment. Dies ist eine Methode zur in-vitro Selektion von Aptameren. Diese kurzen Oligonukleotide werden aus einer Nukleinsäurebank heraus gegen Moleküle selektiert. In einem iterativen Zyklus werden Aptamere generiert, welche die Zielmoleküle spezifisch und mit hoher Affinität binden. Es sollten, sowohl DNA- als auch RNA-Aptamere gegen Histamin und Folsäure sowie gegen die Phytohormone Gibberellinsäure und Indol-3-essigsäure selektiert werden. Eindeutige Ergebnisse der DNA-SELEX konnten innerhalb der Zeitspanne dieser Arbeit nicht erreicht werden. Jedoch konnten die angereicherten Nukleinsäuresequenzen der RNASELEX mit der SOLEXA-Technologie von Illumina sequenziert werden. Es konnten mögliche Aptamer-Sequenzen für Gibberellinsäure und Histamin identifiziert werden, die spezifisch für ihr Zielmolekül sind und mit großer relativer Häufigkeit in dem Nukleinsäurepool vorkommen. Zusätzlich wurden ebenfalls die Sekundärstrukturen von ausgesuchten Sequenzen mit mfold berechnet. Die Strukturen zeigten große Übereinstimmungen. Alle analysierten Sequenzen besitzen Haarnadelstrukturen, mit denen die Zielmoleküle möglicherweise in die Aptamerstruktur integriert werden. Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit war die Optimierung der SELEX-Methode. Durch die halbautomatische Durchführung der DNA-SELEX mit dem Magnetpartikelprozessor „KingFisher Flex“ von Thermo Scientific konnte der Zeit- und Arbeitsaufwand minimiert werden. Auch konnte somit eine bessere Reproduzierbarkeit erreicht werden. Durch die Amplifizierung der selektierten Nukleinsäurefragmente der RNA-SELEX mit der RNA-abhängigen Q-Beta RNA-Polymerase war es nicht notwendig, die RNA-Aptamere in cDNA zu transkribieren. Dies wiederum bedeutet die Einsparung zweier enzymatische Schritte und somit ebenfalls eine Zeitersparnis und die Reduktion von möglichen Fehlern während der Transkription. Das Protokoll der Q-Beta Replikation konnte von vier auf drei Stunden Inkubationszeit verkürzt werden, da festgestellt wurde, dass auch innerhalb von drei Stunden ausreichend RNA repliziert wird. Durch die Reduzierung der Selektionsrunden von 10 bis 15 auf drei, und die verwendete SOLEXA-Sequenzierung, konnte die Dauer der SELEX von 10 bis 45 Tagen auf vier Tage verkürzt werden. Des Weiteren wurden drei aufeinander folgende Replikationen einer Nukleinsäurebank mit der Q-Beta Replikase durchgeführt. In einem Diversitätsassay dieser Replikationen konnte II gezeigt werden, dass die Q-Beta RNA-Polymerase bestimmte Sequenzen einer Nukleinsäurebank bevorzugt amplifiziert. Dies könnte bedeuten, dass selektierte RNAAptamere in der Q-Beta Amplifikation nicht ausreichend repliziert werden und so während der SELEX verloren gehen. Allerdings könnten mit diesem Experiment neue Strukturelemente der RNA gefunden werden, welche zu einer effizienten Q-Beta Replikation führen. In dieser Arbeit konnten einzelne Arbeitsschritte der SELEX-Methode verkürzt werden. Aufbauend auf die Ergebnisse kann die Selektion von Aptameren mit geringerem Arbeitsund Zeitaufwand durchgeführt werden.