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Hochschulschrift

Beiträge zur gerichteten Evolution von Hydrolasen

MPG-Autoren
/persons/resource/persons58724

Krumm,  Holger
Research Department Reetz, Max-Planck-Institut für Kohlenforschung, Max Planck Society;

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Zitation

Krumm, H. (2004). Beiträge zur gerichteten Evolution von Hydrolasen. PhD Thesis, Ruhr-Universität Bochum, Bochum.


Zitierlink: https://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-000F-9685-9
Zusammenfassung
Die vorliegende Dissertationsschrift beschreibt die Arbeiten zu zwei unterschiedlichen Projekten, die beide im Bereich der gerichteten Evolution von Hydrolasen angesiedelt sind.
Das erste Projekt war die Etablierung eines Hochdurchsatz-Screening-Systems und seine Anwendung in der gerichteten Evolution von Hydrolasen.
Bereits seit 1999 existiert im Arbeitskreis Reetz ein Massenspektrometer (MS) mit Elektrospray Ionisations-Quelle (ESI), das zur Analyse von bis zu 1000 asymmetrischen Reaktionen täglich verwendet wird. Das Prinzip beruht auf der gezielten Isotopenmarkierung von Substraten (siehe Kapitel 2). 2002 wurden die technischen Grundlagen zur Steigerung des Durchsatzes durch Parallelisierung der Probeneinspritzung publiziert und ein entsprechendes Gerät angeschafft.[15] Dieses Gerät sollte in Betrieb genommen und seine Leistungsfähigkeit innerhalb eines realen Hochdurchsatz-Assays demonstriert werden (siehe Kapitel 2).
Die Reaktion, die für dieses Projekt ausgewählt wurde, war die enzymatische Hydrolyse von meso-3,5-Diacetoxycyclopenten 1 durch die Bacillus subtilis Lipase lipA (Abbildung 1.2).
Sie war bereits Inhalt von Forschungsarbeiten innerhalb der Dissertation von A. Eipper. Unterschiedliche Mutagenesestrategien zur Verbesserung der Enantioselektivität waren verfolgt worden, insbesondere eine komplette Sättigungsmutagenese, d.h. die Erstellung einer Bibliothek mit allen Enzymvarianten mit genau einem Aminosäureaustausch. Die Arbeiten an dieser Sättigungsbank sollten abgeschlossen werden, zusätzlich wurde ein Ansatz zur Kombination von verbesserten Enzymeigenschaften getestet (siehe Kapitel 3).
Weiterhin sollte die Epoxid-Hydrolase aus Aspergillus niger auf ihre Leistungsfähigkeit in der kinetischen Racematspaltung von trans-β-Methylstyroloxid 4 untersucht werden (Abbildung 1.3). Nach Angaben in der Literatur war für den Wildtyp nur mit sehr geringer oder gar keiner Aktivität in dieser Reaktion zu rechnen.[16, 17]
Die hydrolytische kinetische Racematspaltung von trans-β-Methylstyroloxid 4 ist ein besonders attraktives Ziel für die Biokatalyse, da sie mit chemischen Katalysatoren nur mit unbefriedigenden Ergebnissen durchzuführen ist.[18]
Methoden der gerichteten Evolution sollten angewendet werden, um die Substratakzeptanz des Enzyms zu verbessern (siehe Kapitel 4).
Das zweite Projekt war die Transformation einer Lipase in eine Diels-Alderase. α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen lassen sich durch Komplexierung mit einem Elektrophil, das eine Absenkung der Energie des beteiligten Grenzorbitals bewirkt, für die Diels-Alder-Reaktion aktivieren. Eine solche elektrophile Aktivierung findet, nach dem allgemein anerkannten Mechanismus, auch bei der Hydrolyse von Estern durch Lipasen statt. Daher stellte sich die Frage, ob eine Lipase geeignet ist, durch Wasserstoffbrückenbindung eine α,β-ungesättigte Carbonsäure für die Diels-Alder-Reaktion zu aktivieren (Abbildung 1.4).
Erster Schritt des Projekts sollte die Auswahl und Synthese geeigneter Substrate für eine lipasekatalysierte Diels-Alder-Reaktion sein. Unterschiedliche Enzyme sollten dann mit diesen bezüglich ihrer Fähigkeit, die Diels-Alder-Reaktion zu beschleunigen, getestet werden. Im Falle der Identifizierung einer enzymatischen Aktivität, wäre der zweite Schritt des Projekts die gerichtete Evolution des entsprechenden Enzyms. Letztendliches Ziel ist die Erzeugung einer hoch aktiven Variante (siehe Kapitel 5).