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Hochschulschrift

Kinetic and affinity analysis of hybridization reactions between PNA probes and DNA targets using surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS)

MPG-Autoren
http://pubman.mpdl.mpg.de/cone/persons/resource/persons48552

Park,  Hyeyoung
MPI for Polymer Research, Max Planck Society;

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(beliebiger Volltext), 10MB

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Zitation

Park, H. (2005). Kinetic and affinity analysis of hybridization reactions between PNA probes and DNA targets using surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS). PhD Thesis, Johannes Gutenberg-Universität, Mainz.


Zitierlink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-000F-5D98-7
Zusammenfassung
Sequenz spezifische biomolekulare Analyseverfahren erweisen sich gerade im Hinblick auf das Humane Genom Projekt als äußerst nützlich in der Detektion von einzelnen Nukleotid Polymorphismen (SNPs) und zur Identifizierung von Genen. Auf Grund der hohen Anzahl von Basenpaaren, die zu analysieren sind, werden sensitive und effiziente Rastermethoden benötigt, welche dazu fähig sind, DNA-Proben in einer geeigneten Art und Weise zu bearbeiten. Die meisten Detektionsarten berücksichtigen die Interaktion einer verankerten Probe und des korrespondierenden Targets mit den Oberflächen. Die Analyse des kinetischen Verhaltens der Oligonukleotide auf der Sensoroberfläche ist infolgedessen von höchster Wichtigkeit für die Verbesserung bereits bekannter Detektions - Schemata. In letzter Zeit wurde die Oberflächen Plasmonen feld-verstärkte Fluoreszenz Spektroskopie (SPFS) entwickelt. Sie stellt eine kinetische Analyse - und Detektions - Methode dar, die mit doppelter Aufzeichnung, d.h. der Änderung der Reflektivität und des Fluoreszenzsignals, für das Interphasen Phänomen operiert. Durch die Verwendung von SPFS können Kinetikmessungen für die Hybridisierung zwischen Peptid Nukleinsäure (PNA), welche eine synthetisierte Nukleinsäure DNA imitiert und eine stabilere Doppelhelix formt, und DNA auf der Sensoroberfläche ausgeführt werden. Mittels einzel-, umfassend-, und titrations- Experimenten sowohl mit einer komplementär zusammenpassenden Sequenz als auch einer mismatch Sequenz können basierend auf dem Langmuir Modell die Geschwindigkeitskonstanten für die Bindungsreaktion des oligomer DNA Targets bzw. des PCR Targets zur PNA ermittelt werden. Darüber hinaus wurden die Einflüsse der Ionenstärke und der Temperatur für die PNA/DNA Hybridisierung in einer kinetischen Analyse aufgezeigt. -------------------------------------------------------------------------------- Inhaltszusammenfassung (englisch) Sequence specific analysis of biomolecular has become very useful to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) and to identify genes driven by the human genome project. Due to the enormous number of base-pairs that need to be analysed, sensitive and efficient screening methods are needed that are capable of processing DNA samples in a convenient way. Most of the detection formats include the interaction of immobilized probes and targets with surfaces. The analysis of the kinetic behavior of oligonucleotides at the sensor surface is hence of major importance for the improvement of known detection schemes. Recently, the surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) was developed as a kinetic analysis and a detection method with dual- monitoring of the change of reflectivity and fluorescence signal for the interfacial phenomenon. By using SPFS, kinetic measurements for the hybridization between peptide nucleic acid (PNA), which is a synthesized DNA mimic of nucleic acid forming more a stable duplex with DNA, and DNA were carried out on the sensor surface. Based on the Langmuir model, rate constants were determined for the binding of oligomer DNA targets and PCR targets to PNA with a complementarily matched sequence as well as a mismatched sequence by performing different experiments (single-, global-, and titration-experiment). Furthermore, influences of ionic strength and temperature for PNA/DNA hybridization were demonstrated in kinetic analysis.