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  Investigation of Protein-Ligand Complexes by Native Mass Spectrometry and Ion Mobility-Mass Spectrometry

Göth, M. (2017). Investigation of Protein-Ligand Complexes by Native Mass Spectrometry and Ion Mobility-Mass Spectrometry. PhD Thesis, Freie Universität, Berlin.

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Genre: Hochschulschrift
Andere : Untersuchung von Protein-Ligand Komplexen mittels nativer Massenspektrometrie und Ionenmobilitätsmassenspektrometrie

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MGoeth_diss.pdf (beliebiger Volltext), 8MB
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MGoeth_diss.pdf
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Öffentlich
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application/pdf / [MD5]
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Urheber

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 Urheber:
Göth, Melanie1, Autor           
Pagel, Kevin1, Gutachter           
Schalley, Christoph, Gutachter
Affiliations:
1Molecular Physics, Fritz Haber Institute, Max Planck Society, ou_634545              

Inhalt

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Schlagwörter: native mass spectrometry; ion mobility; protein complexes
 Zusammenfassung: Intermolecular interactions of proteins with each other or with other molecules play a key role in all processes in living organisms. Therefore, proteins represent important therapeutic targets and their structural elucidation is essential for the development of new drugs. Native mass spectrometry (MS) is an attractive tool for the investigation of proteins and their complexes. Molecules are ionized gently and transferred from solution into the gas phase with the aim to maintain inter- and intramolecular non-covalent interactions and the three-dimensional structure. By measuring the mass-to-charge ratio of the ionic species, information on mass, charge, and stoichiometry can be obtained. Native MS is readily compatible with other gas-phase techniques, such as ion mobility spectrometry (IMS) and the combination of both methods, so-called ion mobility-mass spectrometry (IM-MS), provides further structural information on the overall size and shape of a molecule. In this thesis, protein-ligand complexes were investigated using native MS and IM-MS with the aim of evaluating their potential for application in high-throughput analysis for drug discovery. First, native MS was used to elucidate the influence of the standard solvent dimethyl sulfoxide (DMSO) on the protein gas-phase structure and protein-ligand affinity. It was shown that the protein charge-state distribution and likely the gas-phase structure is altered depending on the DMSO concentration. In addition, the protein-ligand affinity decreased with increasing DMSO levels. In a second study, the potential of native MS for fragment-based drug discovery was evaluated. This approach is based on the screening of small molecular fragments against a target and promises higher hit rates and smaller library sizes compared to standard high-throughput screening. Data on four protein systems showed that native MS currently presents a medium- to low-throughput method but can provide valuable insights into protein-ligand interactions that are inaccessible by other techniques. In combination with IMS, the influence of a protein’s microenvironment on its gas-phase structure was investigated. To do so, crown-ether molecules were attached non-covalently to microsolvate positively charged protein side chains, preventing them from collapsing onto the protein backbone. Using tandem MS and IM-MS, the crown-ether binding sites were identified and it was shown that specific side chains stabilize the gas-phase structure even without crown-ether binding. In the last study, IM-MS was successfully tested as a tool for conformational screening of protein-peptide complexes. Only subtle structural differences between the complexes were observed, and a further investigation by collision-induced unfolding and collision-induced dissociation displayed differences in complex stability and unfolding behavior. In summary, native MS and IM-MS are valuable tools for the characterization of protein-ligand interactions. Currently, the methods are limited to a small number of samples, but ongoing developments promise a decisive role in drug discovery in the near future.
 Zusammenfassung: Intermolekulare Wechselwirkungen von Proteinen untereinander oder mit anderen Molekülen, nehmen eine Schlüsselrolle in allen Prozessen lebender Organismen ein. Aus diesem Grund stellen Proteine wichtige therapeutische Angriffspunkte (Targets) dar und ihre strukturelle Aufklärung ist essenziell für die Entwicklung neuer Wirkstoffe. Native Massenspektrometrie (MS) ist ein attraktives Werkzeug, um Proteine und deren Komplexe zu untersuchen. Moleküle werden sanft ionisiert und aus der Lösung in die Gasphase überführt mit dem Ziel, inter- und intramolekulare Wechselwirkungen und die dreidimensionale Struktur aufrechtzuerhalten. Die ionischen Spezies werden durch ihr Masse-zu-Ladungsverhältnis detektiert, was zu Informationen über Masse, Ladung und Stöchiometrie führt. Native MS ist mit anderen Gasphasentechniken, wie Ionenmobilitätsspektrometrie (IMS), gut kompatibel und die Kombination beider Methoden zu Ionenmobilitätsmassenspektrometrie (IM-MS) liefert weitere strukturelle Informationen über die Größe und Form eines Moleküls. In dieser Arbeit wurden Protein-Ligandkomplexe mittels nativer MS und nativer IM-MS mit dem Ziel untersucht, sie hinsichtlich ihres Potentials für die Hochdurchsatzanalyse der Wirkstoffentwicklung zu bewerten. Zuerst wurde native MS eingesetzt, um den Einfluss des Standardlösungsmittels Dimethylsulfoxid (DMSO) auf die Proteingasphasenstruktur, sowie die Protein-Ligandaffinität zu analysieren. Es wurde gezeigt, dass sich je nach DMSO Konzentration in der Probe die Ladungszustandsverteilung und somit vermutlich auch die Gasphasenstruktur eines Proteins ändert. Weiterhin verringerte sich die Affinität des Liganden mit steigender DMSO Konzentration. In einer zweiten Studie wurde das Potential von nativer MS für die fragmentbasierte Wirkstoffentwicklung getestet. In diesem Ansatz werden kleine Molekülfragmente gegen einTarget gescreent, wodurch im Vergleich zum Standardhochdurchsatzverfahren höhere Erfolgsraten bei gleichzeitig geringerer Probenanzahl möglich sind. Ergebnisse von vier getesteten Targetproteinen zeigten, dass native MS im Moment noch keinen großen Durchsatz erlaubt, jedoch wichtige Einblicke in Protein-Ligandkomplexe liefern kann, welche durch andere Methoden nicht ohne Weiteres zugänglich sind. In einer weiteren Studie wurde in Kombination mit IMS der Einfluss der unmittelbaren Proteinumgebung auf dessen Gasphasenstruktur untersucht. Dafür wurden Kronenether-moleküle nichtkovalent gebunden, um positiv geladene Seitenketten zu mikrosolvatisieren und sie dadurch vor einem Zurückfalten auf das Proteinrückgrat zu bewahren. Mit Hilfe von Tandem MS und IM-MS wurden Bindungsstellen der Kronenether identifiziert und darüber hinaus gezeigt, dass bestimmte Proteinseitenketten die Gasphasenstruktur auch ohne Bindung von Kronenether stabilisieren können. In der letzten Studie wurde IM-MS erfolgreich als Methode zum Konformationsscreening von Protein-Peptidkomplexen eingesetzt. Die Komplexe zeigten nur geringe strukturelle Unterschiede, weshalb sie mittels kollisions-induzierter Entfaltung und Dissoziation weiter untersucht und ihre Unterschiede in Stabilität und Entfaltungsverhalten analysiert wurden. Zusammenfassend stellen native MS und IM-MS wertvolle Werkzeuge zur Charakterisierung von Protein-Ligandwechselwirkungen dar. Gegenwärtig sind die Methoden zwar noch nicht für eine große Probenanzahl geeignet, aber durch ständige Entwicklungen werden sie in naher Zukunft sicherlich eine bedeutendere Rolle im Prozess des Wirkstoffdesigns einnehmen können.

Details

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Sprache(n): eng - English
 Datum: 2017-12-07
 Publikationsstatus: Angenommen
 Seiten: X, 165
 Ort, Verlag, Ausgabe: Berlin : Freie Universität
 Inhaltsverzeichnis: -
 Art der Begutachtung: -
 Identifikatoren: URI: http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000106075
URN: urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000106075-8
 Art des Abschluß: Doktorarbeit

Veranstaltung

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Entscheidung

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Projektinformation

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Quelle

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