ausblenden:
Sprache(n):
deu - German
Datum:
2002-08-13
Publikationsstatus:
Angenommen
Seiten:
-
Ort, Verlag, Ausgabe:
Berlin : Freie Universität Berlin
Inhaltsverzeichnis:
1. Einleitung 1
2. Untersuchung der Aggregatbildung von HD Exon 1 Proteinen in Säugetierzellen 3
2.1 Ergebnisse 7
2.1.1 Herstellen von stabilen Zelllinien 7
2.1.2 Bestimmung der optimalen Doxycyclinkonzentration 8
2.1.3 Bestimmung der optimalen Induktionszeit 10
2.1.4 Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von ubiquitinierten Aggregaten
11
2.1.5 Zeitabhängigkeit der Aggregatbildung 13
2.1.6 Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von perinuklearen Aggregaten
14
2.1.7 Cytoplasmatische Aggregate colokalisieren mit dem Centrosom und führen zur zellulären Umverteilung von Vimentin
15
2.1.8 Colokalisation des Proteasoms mit HD Exon 1 Aggregaten 17
2.1.9 Die Inhibierung des Proteasoms verstärkt die Aggregationsbildung 18
2.1.10 Rekrutierung des ER-Chaperons BiP/Grp78 in die perinuklearen Einschlußkörper
20
2.1.11 Colokalisierung von TIA-1, 14-3-3e und a-Synuclein 22
2.1.12 Ultrastruktur der perinuklearen Einschlußkörper 24
2.1.13 Die Expression von mutierten Huntingtinproteinen ist toxisch für 293 Tet-Off Zellen
27
2.2. Diskussion 27
3. Identifizierung und Charakterisierung von HIP1-interagierenden Proteinen
37
3.1 Ergebnisse 37
3.1.1 Strukturanalyse von HIP1 37
3.1.2 Affinitätsreinigung von HIP1-interagierenden Proteinen 39
3.1.3 Identifizierung der HIP1-interagierenden Proteine durch Massenspektrometrie und Immunblotting
39
3.1.4 HIP1 Fragmente, die DxF-Motive enthalten, assoziieren direkt mit der a-Adaptin "Appendage"-Domäne
43
3.1.5 Die coiled-coil-bildende Domäne in HIP1 ist entscheidend für die Bindung an die schwere Kette von Clathrin
45
3.1.6 HIP1 ist mit Clathrin-bedeckten Vesikeln assoziiert 46
3.1.7 Die Überexpression von HIP1 (218-604) in COS-1 Zellen induziert die Bildung von großen vesikelartigen Strukturen
48
3.2 Diskussion 51
4. Materialien und Methoden 57
4.1 Materialien 57
4.1.1 Bakterienstämme 57
4.1.2 Zelllinien 57
4.1.3 Plasmidvektoren 58
4.1.4 Medien und Puffer 60
4.1.5 Oligonukleotide 61
4.1.6 Antikörper 63
4.1.7 Enzyme, Proteine und DNA 64
4.1.8 Chemikalien und Säulenmaterialien 65
4.1.9 Kits 67
4.1.10 Laborausstattung, Geräte und Zubehör 67
4.2 Methoden 70
4.2.1 Grundlegende molekularbiologische Methoden 70
4.2.1.1 DNA-Plasmidpräparation mit Qiagen-Kits 70
4.2.1.2 DNA-Plasmidpräparation über CsCl-Gradient 71
4.2.1.3 Konzentrationsbestimmung der DNA 72
4.2.1.4 Restriktionsverdau von DNA 72
4.2.1.5 Dephosphorylierung von 5´-Phosphatgruppen 72
4.2.1.6 Aufreinigung von DNA-Fragmenten 73
4.2.1.7 DNA Agarose-Gelelektrophorese 73
4.2.1.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 74
4.2.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten 74
4.2.1.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 75
4.2.1.11 DNA-Sequenzierung 75
4.2.1.12 Plasmidkonstruktionen 76
4.2.1.12.1 pTet-CMV-Hyg-CAG20, -CAG51 und -CAG83 76
4.2.1.12.2 HIP1-Plasmide 76
4.2.1.12.2.1 pTL1-HIP1 (218-604) 76
4.2.1.12.2.2 pGEX-HIP1 (218-604) 76
4.2.1.12.2.3 pGEX-6P-1-HIP1, pQE32-HIP1 und pTL1-HA3-HIP1 (1-1003), (1-604), (1-333), (1-217), (218-604) und (334-604)
76
4.2.1.12.3 pGEX-a-Adaptin 77
4.2.1.12.4 pSE111 Helferplasmid für Proteinexpression 77
4.2.2 Grundlegende mikrobiologische Methoden 78
4.2.2.1 Herstellung elektrokompetenter Zellen 78
4.2.2.2 Transformation kompetenter Bakterien mittels Elektroporation 78
4.2.2.3 Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterien 79
4.2.3 Grundlegende proteinbiochemische Methoden 79
4.2.3.1 Expression von rekombinanten GST-Fusionsproteinen in E. coli 79
4.2.3.2 Reinigung von rekombinanten GST-Fusionsproteinen 80
4.2.3.3 Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter nativen Bedingungen
80
4.2.3.4 Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter denaturierenden Bedingungen
81
4.2.3.5 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen 82
4.2.3.6 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 82
4.2.3.7 Coomassie-Färbung von SDS-Gelen 83
4.2.3.8 Western Blot 84
4.2.3.9 Filtertest 85
4.2.3.10 Proteinbindungstest und Peptidkompetitionsstudien 86
4.2.3.11 Protein Overlay-Assay 86
4.2.3.12 Aufreinigung von Clathrin-bedeckten Vesikeln 87
4.2.3.13 Immunmarkierung der Clathrin-bedeckten Vesikel für elektronenmikroskopische Untersuchungen
87
4.2.4 Grundlegende zellbiologische Methoden 88
4.2.4.1 Auftauen von kryokonservierten Säugetierzellen 88
4.2.4.2 Kultivierung und Lagerung von Säugetierzellen 88
4.2.4.3 Trypsinieren von Säugetierzellen 89
4.2.4.4 Bestimmung der Zellkonzentration von kultivierten Säugetierzellen 89
4.2.4.5 Transfektion von Säugetierzellen 89
4.2.4.6 Herstellung der stabilen, induzierbaren Tet-Off Zellen 90
4.2.4.7 Herstellung von Zelllysaten 90
4.2.4.8 Vorbereitung von Zellpräparaten für die Immunfluoreszenzmikroskopie 91
4.2.4.9 Vorbereitung von Zellpräparaten für die Elektronenmikroskopie 92
4.2.4.10 Inhibierung des Proteasoms mit Lactacystin 93
4.2.4.11 Toxizitätstest 93
4.2.5 Grundlegende immunologische Methoden 93
4.2.5.1 Herstellung von polyklonalen Antikörpern 93
4.2.5.2 Affinitätsreinigung von polyklonalen Antikörpern 94
4.2.5.3 IgG-Präparation aus Antiserum 94
4.2.6 Massenspektrometrie 95
4.2.6.1 Aufbereitung der Gelprobe 95
4.2.6.2 MALDI-TOF-MS Probenvorbereitung und Analyse 95
5. Literaturverzeichnis 97
6. EigenePublikationen 108
7. Abkürzungen 109
8. Danksagung 112
9. Zusammenfassung 113
10. Abstract 115
Art der Begutachtung:
-
Identifikatoren:
eDoc: 30255
Art des Abschluß:
Doktorarbeit
