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Language(s):
deu - German
Dates:
2003
Publication Status:
Accepted / In Press
Pages:
-
Publishing info:
Berlin : Freie Universität
Table of Contents:
0 ABKÜRZUNGEN 6
1 EINLEITUNG 8
1.1 PROTEINBIOSYNTHESE 8
1.2 STRUKTUR DES RIBOSOMS 8
1.3 ABLAUF DER PROTEINBIOSYNTHESE 11
1.3.1 Initiation 11
1.3.2 Elongation 12
1.3.3 Elongationsmodelle 12
1.3.3.1 Hybridstellen-Modell 12
1.3.3.2 α-ε-Modell 14
1.4 TERMINATION UND RECYCLING 16
1.5 ZIELSETZUNG 19
2 MATERIAL UND METHODEN 20
2.1 BEZUGSQUELLEN VON CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 20
2.2 BAKTERIENSTÄMME UND PLASMIDE 22
2.2.1 Bakterienstämme 22
2.2.2 Plasmide 23
2.3 PUFFER, LÖSUNGEN UND MIKROBIOLOGISCHE MEDIEN 24
2.3.1 Gellösungen und Elektrophorhesepuffer 24
2.3.1.1 Agarosegele 24
2.3.1.2 Protein-SDS-Polyacrylamidgele 25
2.3.1.3 Polyacrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen (RNA) 26
2.3.2 Pufferlösungen 26
2.3.2.1 Puffer für Plasmidisolierungen 26
2.3.2.2 Puffer für Ni-NTA Spin Kit 27
2.3.2.3 Puffer für molekulargenetische Methoden 28
2.3.2.4 Puffer für Watanabe-Assay 28
2.3.3 Mikrobiologische Medien 30
2.4 ANALYTISCHE METHODEN 30
2.4.1 Photometrische Konzentrationsbestimmungen 30
2.4.2 Radioaktivitätsmessung 31
2.4.3 Elektrophoresen 32
2.4.3.1 Agarose-Gelektrophorese 32
2.4.3.2 Protein-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 32
2.4.3.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (RNA-Gele) 34
2.5 MIKROBIOLOGISCHE UND MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 35
2.5.1 Anzucht und Konservierung von E. coli 35
2.5.2 Herstellung von transformationskompetenten Zellen für die Elektroporation 36
2.5.3 Transformation mittels Elektroporation 36
2.5.4 Restriktionsverdau von DNA 37
2.5.5 Ligation von DNA-Fragmenten 38
2.5.6 Ligation und Transformation unter Verwendung des Topo® TA Kloning® Kit 39
2.5.7 Synthese von kurzen dsDNA-Fragmenten mittels Klenow-Reaktion 40
2.5.8 In vitro Transkription mittels T7-Polymerase 41
2.5.9 Polymerase-Kettenreaktion 42
2.5.10 Klonierung des RF3-Gens (prfC) aus E. coli XL1-Blue 43
2.5.10.1 Klonierungsstrategie 43
2.5.10.2 Primerauswahl 44
2.5.11 Überexpression des klonierten RF3-Gens in HB101 (RF3-pQE70Klon2) 45
2.6 PRÄPARATIVE METHODEN 45
2.6.1 Plasmidisolierung 45
2.6.2 Reinigung von DNA über Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 46
2.6.3 Phenol-Chloroform-Isoamyalkohol Extraktion 46
2.6.4 Ethanol-Präzipitation von DNA 47
2.6.5 Präparative Aufreinigung von mRNA aus Polyacrylamidgelen 47
2.6.6 Reinigung von His6-markierten Proteinen (Ni-NTA Spin Kit) 48
2.7 IN VITRO-SYSTEME 48
2.7.1 Watanabe Assay 48
2.8 COMPUTERGESTÜTZTE METHODEN 54
2.8.1 Sekundärstrukturanalyse von RNA 54
2.8.2 Sequenzvergleiche von Genen aus verschiedenen Organismen 54
3 ERGEBNISSE 55
3.1 KLONIERUNG VON RF3 55
3.1.1 Verschachtelte PCR: Amplifikation mit Taq-Polymerase und Klonierung in pQE-70 57
3.1.2 Amplifikation mit Taq-Polymerase und Ligation in pCRâII-Topoâ 58
3.1.3 Amplifikation mit Pwo-DNA-Polymerase, Klonierung in pCRâII-Topoâ und Subklonierung in pQE-70 59
3.2 IN VIVO KOMPLEMENTATION DES KÄLTE-SENSITIVEN STAMMES CL5 DURCH MUTRF3PQE70 UND RF3PQE70 61
3.3. AMINOSÄUREVERGLEICH DER RF3-GENE VERSCHIEDENER ORGANISMEN 62
3.4 ÜBEREXPRESSION DES KLONIERTEN RF3-GENS 64
3.5 REINIGUNG DES HIS6-MARKIERTEN RF3 ÜBER NI2+-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE 65
3.6 ENTWURF UND HERSTELLUNG HETEROPOLYMERER MRNAS 66
3.6.1 Entwurf und Optimierung der mRNA-Sequenzen 66
3.6.2 Klonierung der DNA-Konstrukte zur Synthese der mRNAs 69
3.6.3 T7 Transkription und Reinigung der mRNA 70
3.7 FUNKTIONSANALYSE DER MRNA: STELLENSPEZIFISCHE TRNA-BINDUNG (WATANABE ASSAY) 72
3.7.1 Watanabe Assay im Standard-System 73
3.7.2 Watanabe Assay als Funktionstest der MFStop-mRNA 74
3.7.2.1 Etablierung des Pi-Zustandes mit Formyl-Methionyl-tRNAfMet für MFStop-mRNA 75
3.7.2.2 Etablierung der drei funktionellen Zustände mit N-Acetyl-[14C]Phenylalanyl-tRNAPhe für MFStop-mRNA 76
4 DISKUSSION 78
4.1 KLONIERUNG VON RF3 78
4.2 ENTWURF UND HERSTELLUNG HETEROPOLYMERER MRNAS – SYNTHESE UND ISOLIERUNG VON MFSTOP- UND 8CODONSTOP-MRNA 80
4.3 FUNKTIONSANALYSE DER MRNAS 81
5 AUSBLICK 82
6 ZUSAMMENFASSUNG 83
7 REFERENZEN 84
8 DANKSAGUNG 90
Rev. Type:
-
Identifiers:
eDoc: 194838
Degree:
Diploma
