Deutsch
 
Hilfe Datenschutzhinweis Impressum
  DetailsucheBrowse

Datensatz

 
 
DownloadE-Mail
  Isolierung und Charakterisierung exprimierter Sequenzen im Bereich des MID1 Gens

Lehmann, T. (2003). Isolierung und Charakterisierung exprimierter Sequenzen im Bereich des MID1 Gens. PhD Thesis, Medizinische Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin.

Item is

Dateien

einblenden: Dateien
ausblenden: Dateien
:
PhD-Lehmann.pdf (beliebiger Volltext), 2MB
 
Datei-Permalink:
-
Name:
PhD-Lehmann.pdf
Beschreibung:
-
OA-Status:
Sichtbarkeit:
Eingeschränkt (Max Planck Institute for Molecular Genetics, MBMG; )
MIME-Typ / Prüfsumme:
application/pdf
Technische Metadaten:
Copyright Datum:
-
Copyright Info:
eDoc_access: MPG
Lizenz:
-

Externe Referenzen

einblenden:

Urheber

einblenden:
ausblenden:
 Urheber:
Lehmann, Tanja1, Autor
Affiliations:
1Max Planck Society, ou_persistent13              

Inhalt

einblenden:

Details

einblenden:
ausblenden:
Sprache(n): deu - German
 Datum: 2003
 Publikationsstatus: Angenommen
 Seiten: 87 S.
 Ort, Verlag, Ausgabe: Berlin : Medizinische Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin
 Inhaltsverzeichnis: 1 Einleitung ............................... 6
1.1 Opitz Syndrom .......................... 6
1.2. Embryologie............................ 7
1.3 Das MID1-Gen ........................... 9
1.3.1 Klonierung, genomische Anordnung...... 9
1.3.2 Proteinfamilie ...................... 10
1.3.3 Mutationsanalysen.................... 11
1.3.4 Konservierung von MID1 in der Maus .. 12
1.3.5 Expression des MID1-Gens ............ 12
1.3.6 Funktion des MID1-proteins.............................. 13
1.4 Wachstumsfaktoren...................... 13
1.5 Fugu rubripes als Modellorganismus .... 14
1.6 Fragestellung und Zielsetzung................................ 15
2 Material und Methoden ................... 16
2.1 Material .............................. 16
2.1.1 Medien und Puffer ................... 16
2.1.2 Restriktionsenzyme .................. 17
2.1.3 Vektoren............................. 18
2.1.4 Primer .............................. 18
2.1.4.1 Primersequenzen im Fugu-Cosmid................................ 18
2.1.4.2 Primersequenzen in humaner MID1-cDNA.................................. 19
2.1.4.3 andere Primersequenzen............. 20
2.1.5 Zellinien ........................... 21
2.2 Methoden .............................. 22
2.2.1 Elektrophoresetechniken ............. 22
2.2.1.1 Horizontalgelelektrophorese........ 22
2.2.1.1.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese.... 22
2.2.1.1.2 RNA-Elektrophorese denaturierend.)............................ 22
2.2.1.2 Vertikalgelelektrophorese: Sequenzgel ........................................... 22
2.2.2 Nukleinsäuren Präparation ........... 23
2.2.2.1 Cosmid Präparation................. 23
2.2.2.2 Genomische DNA-Isolierung ......... 23
2.2.2.2.1 Aus Zellinien ................... 23
2.2.2.2.2 Aus Geweben ..................... 24
2.2.2.3 Plasmid-DNA-Isolierung............. 24
2.2.2.4 DNA-Isolierung aus Agarose ........ 24
2.2.2.5 Aufreinigung von PCR-Produkten .... 24
2.2.2.6 Total RNA-Isolierung................24
2.7 Poly-A+ RNA-Isolierung ................ 25
2.2.3 Klonierungstechniken ................ 25
2.2.3.1 Herstellung DH5a kompetenter Zellen E. coli ........................................... 25
2.2.3.2 Ligation -......................... 25
2.2.3.2.1 Dephosphorylierung des Vektors .. 25
2.2.3.2.2 Ligation „Sticky Ends“...................................... 26
2.2.3.2.3 Ligation „Blunt End“....................................... 26
2.2.3.2.4 TA-Klonierung für PCR-Produkte............................... 26
2.2.3.3 Transformation......................26
2.2.3.4 Restriktionsverdau................. 27
2.2.3.5 Deletionsklonierung................ 27
2.2.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR)...... 28
2.2.4.1 Standard-PCR....................... 28
2.2.4.2 Long-Distance-PCR ................. 28
2.2.4.3 RT-PCR ............................ 29
2.2.4.4 5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ........................................... 29
2.2.4.5 3’RACE ............................ 31
2.2.4.6 DNA Sequenzierung.................. 31
2.2.4.6.1 Sequenzreaktion.................. 31
2.2.4.6.2 Sequenzierung von Plasmiden...... 32
2.2.4.6.3 Sequenzierung von PCR-Produkten.. 32
2.2.4.6.4 Primer-Walking................... 32
2.2.5 Transfertechniken ................... 32
2.2.5.1 Southern Blot...................... 32
2.2.5.1.1 Trockenblot ..................... 32
2.2.5.1.2 Naßblot ......................... 33
2.2.5.2 Northern Blot ..................... 33
2.2.6 Hybridisierungstechniken ............ 34
2.2.6.1.1 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA Sonden (1) ................................ 34
2.2.6.1.2 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA-Sonden (2)............................. 34
2.2.6.2 Hybridisierung von Southern Blots...................................... 34
2.2.6.3 Hybridisierung von Northern Blots, Schnellhybridisierung ..................... 35
2.2.6.4 Autoradiographie .................. 35
2.2.6.5 Herstellung von Hybridisierungsproben ........................................... 35
2.2.7 Zellkultur........................... 36
2.2.7.1 Umsetzen von Zellinien ............ 36
2.2.7.2 Einfrieren von Zellinien .......... 36
2.2.7.3 Auftauen von Zellkulturen ......... 36
2.2.7.4 Ernten von Zellen ................. 36
2.2.7.5 Wachstumsfaktor-Stimulationsessay . 37
2.2.8 Computerprogramme ................... 38
2.3 Abkürzungen ........................... 38
3 Ergebnisse .............................. 39
3.1 Arbeitsplan ........................... 39
3.1.1 Suche nach neuen exprimierten Exons...................................... 39
3.1.2 Charakterisierung der MID1-Transkriptionsregulation ........................................... 39
3.2 MID1-Ortholog bei Fugu rupripes........ 40
3.2.1 Cosmidauswahl........................ 40
3.2.2 Cosmidsequenzierung.................. 41
3.2.3 Cosmidanalyse........................ 44
3.3.1 Nukleotidebene ...................... 44
3.3.2 Proteinebene......................... 44
3.4 Untersuchung der Exonvorhersagen ...... 49
3.4.1 Zoo-Blot Untersuchungen ............. 54
3.5 Promoteranalyse ........................................... 57
3.6 Humane MID1-Transkription ............. 58
3.6.1 Modellsystem: Zellinie 18/98 ........ 58
3.6.2 Suche nach neuen exprimierten Sequenzen.................................. 58
3.6.2.1 ORF................................ 58
3.6.2.2 3’UTR.............................. 60
3.6.2.3 5’UTR.............................. 61
3.6.3 Charakterisierung der MID1-Transkriptionsregulation ........................................... 62
3.6.3.1 Expressionsstudien .................62
3.6.3.2 Charakterisierung der MID1-Transkripte ........................................... 63
3.6.4 MID1-Transkription bei OS-Patienten.. 64
3.6.4.1 OS-Patient 5174 ................... 64
3.6.4.2 OS-Patient 165/98 ................. 66
3.7 MID1 und Wachstumsfaktor TGF-beta3 .... 70
3.7.1 MID1-Transkription und TGF-beta3 .... 70
3.7.2 TGF-beta3 spezifische MID1-Regulation bei OS-Patient 165/98 .................................... 71
4 Diskussion .............................. 72
4.1 Suche nach exprimierten Sequenzen ..... 72
4.1.1 Das Fugu MID1-Ortholog .............. 72
4.1.2 Fugu-Exons .......................... 73
4.2 Regulationsstudien auf Transkriptionsebene ........................................... 75
4.2.1 MID1-Transkription................... 76
4.2.2.1 Regulatorische Elemente des MID1-Gens.................................. 76
4.2.3 MID1-Transkription in OS-Patienten...................... ........ 77
4.2.3.1 MID1-Transkription - OS-Patient 5174 ........................................... 77
4.2.3.2 MID1-Transkriptionsregulation - OS-Patient 165/98 ........................................... 78
4.2.4 MID1-Promoter ....................... 79
4.3 Ausblick .............................. 80
5 Zusammenfassung ......................... 82
6 Literatur................................ 83
 Art der Begutachtung: -
 Identifikatoren: eDoc: 194767
 Art des Abschluß: Doktorarbeit

Veranstaltung

einblenden:

Entscheidung

einblenden:

Projektinformation

einblenden:

Quelle

einblenden: