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  Molekulare Charakterisierung des MID1-Gens

Winter, J. (2003). Molekulare Charakterisierung des MID1-Gens. PhD Thesis, Freie Universität, Berlin.

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PhD-Winter.pdf (Any fulltext), 2MB
 
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-
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PhD-Winter.pdf
Description:
-
OA-Status:
Visibility:
Restricted (Max Planck Institute for Molecular Genetics, MBMG; )
MIME-Type / Checksum:
application/pdf
Technical Metadata:
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-
Copyright Info:
eDoc_access: MPG
License:
-

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 Creators:
Winter, Jennifer1, Author           
Affiliations:
1Dept. of Human Molecular Genetics (Head: Hans-Hilger Ropers), Max Planck Institute for Molecular Genetics, Max Planck Society, ou_1433549              

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Language(s): deu - German
 Dates: 2003-11-14
 Publication Status: Accepted / In Press
 Pages: 126 S.
 Publishing info: Berlin : Freie Universität
 Table of Contents: 1. Einleitung.........................4
1.1 Opitz BBB/G Syndrom...............4
1.2 Das MID1-Gen......................4
1.3 Mutationen im MID1-Gen............5
1.4 Das MID1-Protein..................5
1.5 Die Funktion des MID1-Proteins....8
1.6 MID2..............................9
1.7 Expression von MID1 in der Maus..10
1.8 MID1 in Fugu rubripes............11
1.9 Alternatives Spleißen............11
1.10 Durch vorzeitiges Stopkodon-vermittelter mRNA-Abbau...........................13
1.11 Alternativ gespleißte Transkripte mit vorzeitigen Stopkodons...........................14
1.12 Regulatorische RNAs.............15
1.13 Fragestellung und Zielsetzung...15
2. Material und Methoden.............17
2.1 Materialien und Chemikalien......17
2.1.1 Chemikalien....................17
2.1.2 Puffer und Lösungen............18
2.1.3 Enzyme.........................21
2.1.4 Primer.........................22
2.1.5 Vektoren.......................24
2.1.6 Zelllinien.....................24
2.1.7 Biologisches Material..........25
2.2 Methoden.........................25
2.2.1 Molekularbiologische Methoden.............................25
2.2.1.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese25
2.2.1.2 Denaturierende RNA-Gelelektrophorese................25
2.2.1.3 Isolierung genomischer DNA aus Fibroblasten.........................25
2.2.1.4 Plasmid-DNA-Isolierung.......26
2.2.1.5 DNA-Isolierung aus Agarose...26
2.2.1.6 Aufreinigung von PCR-Produkten..27
2.2.1.7 Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellinien...............................27
2.2.1.8 Isolierung von Gesamt-RNA aus Mausgeweben.............................27
2.2.1.9 Isolierung von PolyA+ RNA aus Gesamt-RNA..............................27
2.2.1.10 Standard PCR ..................27
2.2.1.11 RT-PCR.........................28
2.2.1.12 3’und 5’Race.....................29
2.2.1.13 In vitro Mutagenese der Isoform Ex2d.7 (im pGemT easy Vektor)............................29
2.2.1.14 Sequenzierung..................30
2.2.1.15 TA-Klonierung von PCR-Produkten30
2.2.1.16 Klonierung der MID1-Konstrukte in den pBTM116 Vektor..................................31
2.2.1.17 Umklonierung der Isoformen Ex2d.7, Ex2f.1 und Exi6.1 vom pBTM116 Vektor in den pBudCE4 Vektor..................................32
2.2.1.18 Southernblot...................32
2.2.1.19 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA-Sonden für die Southernblot Hybridisierung.....33
2.2.1.20 Southernblot-Hybridisierung....33
2.2.1.21 Northernblot...................34
2.2.1.22 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA-Sonden für die Northernblot-Hybridisierung.....34
2.2.1.23 Markierung und Aufreinigung radioaktiver RNA-Sonden für die Northernblot-Hybridisierung.....35
2.2.1.24 Markierung und Aufreinigung von Oligonukleotidproben für die Northernblot-Hybridisierung.............35
2.2.1.25 Northernblot-Hybridisierung....36
2.2.2 Proteinbiochemische Methoden......36
2.2.2.1 Proteinbestimmung nach Bradford................................36
2.2.2.2 Westernblot.....................37
2.2.2.3 Immunfluoreszenz................38
2.2.2.4 Mikrotubuli-Präparation.........39
2.2.2.5 2D-Gelelektrophorese............39
2.2.3 ß-Galaktosidase-Assay.............40
2.2.3.1 Hefe-Transformation.............40
2.2.3.2 ONPG-Flüssigassay...............41
2.2.4 Sequenzanalyse....................42
3. Ergebnisse...........................44
3.1 Auswirkungen bekannter MID1-Mutationen auf die PP2A-abhängige Phosphorylierung Mikrotubulus-assoziierter Proteine in embryonalen Fibroblasten von OS-Patienten............................44
3.2 Auswirkungen einer Punktmutation in der BBox2 des MID1-Proteins auf die Mikrotubulus-Assoziation von α4......................................45
3.3 Erkennung von Mutationen in der MID1-mRNS...............................47
3.4 Regulation von MID1....................................49
3.4.1 Nix-Analyse des MID1-Gens.........49
3.4.1.1 Nix-Analyse des humanen MID1-Gens...............................50
3.4.1.2 NIX-Analyse von MID1 in der Maus....................................50
3.4.2 PipMaker-Analyse zwischen Mensch und Maus zur Charakterisierung konservierter Bereiche im MID1-Gen................................50
3.4.3 Exprimierte Sequenzen im humanen MID1-Gen................................52
3.4.4 Exprimierte Sequenzen in der Maus....................................68
3.4.5 Gewebsspezifische Expression der alternativen Exons in Mensch und Maus.........................73
3.4.6. N-terminal trunkierte MID1-Proteine.......................... 78
3.4.7 C-terminal trunkierte MID1-Proteine.......................... 80
3.4.8 Identifizierung von neuen Protein-Domänen in den alternativ gespleißten MID1-Isoformen.. 85
3.4.9 NMD als Regulationsmechanismus....86
3.4.10 Region 1d........................89
4. Diskussion...........................93
4.1 Auswirkungen bekannter MID1-Mutationen auf die PP2A-abhängige Phosphorylierung mikrotubulus-assoziierter Proteine in embryonalen Fibroblasten von OS-Patienten............................93
4.2 Auswirkungen einer Punktmutation in der BBox2 des MID1-Proteins auf die Mikrotubulus-Assoziation von α4......................................94
4.3 Erkennung von Mutationen in der mRNS....................................94
4.4 Regulation der MID1-Expression durch alternatives Spleißen und regulatorische RNAs........95
4.4.1 Alternativ gespleißte Transkripte im MID1-Gen von Mensch, Maus und Fugu...................96
4.4.2 Gewebsspezifische Expression der alternativ gespleißten MID1-Transkripte in Mensch und Maus....................................98
4.4.3 N-terminal trunkierte Proteine...100
4.4.4 C-terminal trunkierte Proteine...101
4.4.5 Identifizierung von neuen Protein-Domänen in den alternativ gespleißten MID1-Isoformen..104
4.4.6 Durch Stopkodons vermittelter mRNA-Abbau.............................105
4.4.7 Region 1d........................106
5. Zusammenfassung.....................110
6. Summary.............................112
7. Ausblick............................114
8. Abkürzungen.........................116
9. Literatur...........................118
10. Danksagung.........................123
11. Publikationen......................124
12. Curriculum Vitae...................125
 Rev. Type: -
 Identifiers: eDoc: 194822
 Degree: PhD

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