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Zur Identifizierung wichtiger Signalgene beim Schlaganfall im Mausmodell wurden
Genexpressionsprofile mit Hilfe der Affymetrix-GeneChip-Technologie anfertigt und
mir zu Beginn dieser Arbeit zur Verfügung gestellt. Diese wurden mit einer unabhängigen
Methode, der quantitativen real-time PCR, validiert. Dazu wurde in Wildtypmäusen
(C57 black six) ein sechzigminütiger Verschluss der Arteria cerebri media verursacht
und die Genexpressionsstärke von differentiell exprimierten Genen zu vier verschiedenen
Zeitpunkten bestimmt. Es wurden Expressionswerte der ipsilateralen Hemisphäre
relativ zur kontralateralen Gehirnhälfte errechnet und diese Werte anschließend graphisch
mit den zu validierenden Hybridisierungsdaten verglichen. Von den 150 untersuchten
Genen konnten 96 (63%) angesichts ihrer im Trend gleichförmigen Hoch- bzw.
Herunterregulierung sehr gut belegt werden. Weitere 34% wurden aufgrund des Abweichens
eines Messpunktes vom gesamten Trend als relativ gut validiert beurteilt. Für 3%
bzw. 4 Gene konnte auf keine Bestätigung der Hybridisierungsdaten geschlossen werden.
Aus Reproduzierbarkeitsexperimenten ergab sich eine mittlere Abweichung der
CT-Werte von ±0,9 bzw. ein Fold Change-Wert von ±1,87.
Die Expression einzelner, ausgewählter Proteine, z.B. Mt2, Blnk, Ccl9, Hmgb1, Plaur
und Tlr2 sollte immunohistochemisch überprüft werden. Dabei auftretende Schwierigkeiten
konnten noch nicht vollständig gelöst werden. Hierzu gehört die schlechte Fixierung
des Gewebes aufgrund der ungenügenden Postfixierung mit PFA bzw. mit einem
Methanol/Aceton-Gemisch. Gewebeschnitte PFA-perfusionsfixierter Mäusehirne konnten
jedoch eine verbesserte Fixierung vorweisen und zusätzlich eine Spezifitätserhöhung
der immunohistochemischen Färbung von Ccl9 ermöglichen. Bei Mt2 und Blnk
führte erst das Verwenden eines Mouse-On-Mouse-Kits zur Detektion des Antigens mit
monoklonalen Mausantikörpern. Die zu erwartende Regulierung von Hmgb1 und Tlr2
konnte teilweise dargestellt werden.
Eine Zuordnung der differentiell exprimierten Gene war nur zu den bereits bekannten
Signalwegen der Entzündung, der Apoptose und Zelldifferenzierung möglich.
