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  Die Rolle des Origin Recognition Complex in Zellzyklus, Zentrosomenzyklus und Mikrotubuliorganisation in Drosophila SL2-Zellen

Hallung, N. (2009). Die Rolle des Origin Recognition Complex in Zellzyklus, Zentrosomenzyklus und Mikrotubuliorganisation in Drosophila SL2-Zellen. Diploma Thesis, Freie Universität Berlin, Berlin.

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Item Permalink: https://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7DFC-3 Version Permalink: https://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7DFD-1
Genre: Thesis

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:
Hallung_Final010309.pdf (Any fulltext), 2MB
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File Permalink:
https://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7DFB-5
Name:
Hallung_Final010309.pdf
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-
OA-Status:
Visibility:
Public
MIME-Type / Checksum:
application/pdf / [MD5]
Technical Metadata:
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-
Copyright Info:
eDoc_access: PUBLIC
License:
-

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 Creators:
Hallung, Nicole1, Author           
Affiliations:
1Dept. of Vertebrate Genomics (Head: Hans Lehrach), Max Planck Institute for Molecular Genetics, Max Planck Society, ou_1433550              

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Free keywords: -
 Abstract: Zusammenfassung Die Kontrolle der Replikation der DNA ist einer der wichtigsten Vorgänge für die gleiche Verteilung aller Determinanten auf die zwei Tochterzellen. Die Initiation der Replikation wird durch einen aus sechs Untereinheiten bestehenden Proteinkomplex, den Origin Recognition Complex (ORC), bewerkstelligt. Dieser in allen Eukaryoten hochkonservierte Komplex erkennt die origins of replication und rekrutiert zusätzlich Initiationsfaktoren, wie Cdc6 oder minichromosome maintenance-Komplex-Proteine, an die DNA. Studien zeigen, dass die Depletion von ORC-Proteinen zu DNA- und Replikations-Defekten führt. Zudem wurde immer wieder über zusätzliche Funktionen der ORC-Proteine im Zentrosomenzyklus spekuliert, da sowohl zentrosomale Lokalisationen als auch zentrosomale Co-Aufreinigungen für einige ORC-Proteine gezeigt werden konnten. Auch gab es Hinweise, dass ORC-Proteinabbau zu Zentrosomen-Aberrationen führt. Das Auftreten von Abweichungen in der Zentrosomenanzahl oder -struktur sind auch typische Ereignisse in Tumoren. Lange war unklar, ob diese als Ursache oder Folge der Krebsentstehung betrachtet werden müssen. Mittlerweile konnten jedoch Zentrosomenanomalien als Kausalität der Krebsentstehung gezeigt werden. Um komplexe Zusammenhänge bei der Krebsentstehung zu verstehen, ist es wichtig weitere Regulatoren der eng gekoppelten Zyklen der Zell- und Zentrosomenteilung zu identifizieren. In RNAi-Versuchen in Drosophila SL2-Zellen sollte in dieser Arbeit der Einfluss der ORC-Proteine auf den Zellzyklus, die Zentrosomenstruktur und die Mikrotubuliorganisation untersucht werden. Dabei konnten signifikante Effekte für einzelne ORC-Untereinheiten, nicht nur auf die DNA, sondern auch auf die Anzahl und Struktur von Zentrosomen gezeigt werden. Um biochemische Zusammenhänge aufzuklären, wurde eine Charakterisierung der latheo(lat)/Orc3-Untereinheit mittels Tandem-Affinitäts-Aufreinigung durchgeführt, wodurch γ-Tubulin als Interaktionspartner von lat/Orc3 identifiziert wurde. Diese Interaktion ist im Einklang mit einer Co-Lokalisation von lat/Orc3 und γ-Tubulin am Zentrosom, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie bestätigt wurde. Zusammenfassung Diese Ergebnisse lassen auf eine Rolle der ORC-Proteine nicht nur für die DNA-Replikation, sondern auch für den Zentrosomenzyklus schließen.

Details

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Language(s): deu - German
 Dates: 2009-03-03
 Publication Status: Accepted / In Press
 Pages: 83
 Publishing info: Berlin : Freie Universität Berlin
 Table of Contents: Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung................................................1
1.1. Die Replikation der DNA in Eukaryoten.................................................1
1.2. Der Origin Recognition Complex..................................................2
1.3. Mitose und Zellzyklusregulation....................................4
1.4. Checkpoint-Kontroll-Mechanismen.........................6
1.4.1. Der DNA-Replikations-Checkpoint.............................6
1.4.2. Der Spindle-Assembly-Checkpoint.............................7
1.4.3. Der Spindle-Position-Checkpoint.............................7
1.4.4. Die DNA-Damage-Checkpoints..................................7
1.5. Das Zentrosom und die Spindel.................................................8
1.6. Zentrosomen und Krebs...................................................12
1.7. Fragestellung......................................
Methoden................................................15
2.1. Antikörper..............................................15
2.2. Biochemische Methoden.................................................16
2.2.1. SDS-PAGE..........................................16
2.2.2. Coomassie-Färbung........................................17
2.2.3. Western Blot.....................................................17
2.2.4. Wiederverwendung der Western Blot-Membran.............................................17
2.2.5. Protein-Präzipitation mit Trichloressigsäure.......................................18
2.2.6. TAP......................................................18
2.2.7. FACS.....................................................19
2.3. Molekularbiologische Methoden.................................................19
2.3.1. Isolierung genomischer DNA aus Drosophila...............................................19
2.3.2. Primer-Design für RNAi.....................................................20
2.3.3. Polymerase-Kettenreaktion................................23
2.3.4. Agarose-Gel-Elektrophorese...............................24
2.3.5. Gelelution...............................................24
2.3.6. Plasmid-Präparation......................................25
2.3.7. MidiPrep.................................................25
2.3.8. RNAi..............................................25
Inhaltsverzeichnis
——————————————————————————––————————–
2.3.9. Klonierung des latheo-Gens für TAP......................................................26
2.3.10. Restriktionsenzyme.......................................27
2.3.11. Transformation...........................................28
2.3.12. RNA-Synthese.............................................28
2.3.13. RNA-Hybridisierung.......................................29
2.4. Zellkultur...............................................29
2.4.1. Zelllinien........................................29
2.4.2. Kultivierung.............................................30
2.4.3. Stabile Transfektion von SL2-Zellen...............................................30
2.4.4. Induktion stabiler SL2-TAP Zellen...................................................31
2.5. Mikroskopie..............................................31
2.5.1. Immunfluoreszenzfärbung..................................31
2.5.2. Mikroskopie..............................................32
2.5.3. Bildbearbeitung..........................................32
2.5.4. Quantifizierung der Zellzahl.................................................33
2.5.5. Quantifizierung von Phänotypen...............................................33
2.5.6. Berechnung der Signifikanz..............................................33
2.6. Pufferliste.......................................
Ergebnisse...............................................40
3.1. Darstellung der normalen Zellzyklusphasen in Drosophila SL2-Zellen...............................................40
3.2. Untersuchung auf Zellzyklusdefekte........................................44
3.2.1 Untersuchung des mitotischen Index....................................................44
3.2.2. Die Verteilung der mitotischen Phasen...................................................46
3.2.3. FACS-Analyse.............................................47
3.3. Untersuchung auf zentrosomale Defekte..................................................50
3.3.1. Zentrosomenanzahl.................................50
3.3.2. Zentrosomenform..........................................53
3.4. Untersuchung auf Defekte der Mikrotubuli..............................................56
3.4.1. Untersuchung der Astralmikrotubuli........................................56
3.4.2. Untersuchung auf das Vorhandensein von MTOCs....................................................58
3.5. Untersuchung auf chromosomale Defekte..................................................59
3.6. Charakterisierung von latheo/Orc3..............................................62
Inhaltsverzeichnis
——————————————————————————––————————–
3.6.1. Expressionsvektoren......................................62
3.6.2. Proteinaufreinigung mittels Tandem Affinity Purification.............................................63
3.6.3. Proteininteraktion................................65
3.6.4. Co-Lokalisation..........................................66
4. Diskussion............................................67
4.1. Zellzyklusdefekte........................................67
4.2. Der Einfluss auf das Zentrosom................................................69
4.3. Der Einfluss auf die Mikrotubuli..............................................70
4.4. DNA-Defekte..............................................70
4.5. Charakterisierung von lat/Orc3.................................................72
5. Abkürzungsverzeichnis.................................74
6. Tabellenverzeichnis......................................76
7. Abbildungsverzeichnis....................................77
8. Literatur................................................78
 Rev. Type: -
 Identifiers: eDoc: 444328
 Degree: Diploma

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