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Abstract:
Zusammenfassung:
Die Skelettentwicklung unterliegt komplexen regulatorischen Mechanismen und viele Krankheiten
sind mit Mutationen in den Genen, die zu diesem Prozess beitragen, assoziiert. Bis
heute ist das gesamte Netzwerk an Faktoren, die in diese Vorgänge involviert sind, noch
nicht vollständig aufgeklärt. Deswegen lag der Fokus dieser Arbeit auf der Identifikation von
neuen Genen mit einer relevanten Funktion für die Skelettentwicklung.
Die Expression des Transkriptionsfaktors Mef2c war in embryonalen Humeri von Runx2-/-
Mäusen reduziert [Hecht et al., 2007]. Expressionsanalysen zeigten mRNA Transkript von
Mef2c im Perichondrium, den prähypertrophen und hypertrophen Chondrozyten von Humeri
zum embryonalen Stadium E15,5. Dies ließ eine Rolle von Mef2c in der Skelettentwicklung
vermuten. Funktionelle Untersuchungen in vitro in mesenchymalen Hühnerzellen,
die eine osteoblastische Differenzierung durchliefen und in Hühner Micromass Kulturen
zeiten, daß eine retrovirale Überexpression von Mef2c die Transkriptmenge der Differenzierungsmarker
Col10a1, Ibsp, Akp2, Ihh und Pthr1 erhöhte.
Die Cre/lox vermittelte Deletion von Mef2c im Gliedmaßenmesenchym und in Chondrozyten
führte zu einem kurzgliedrigen Phänotyp mit einer Verzögerung der hypertrophen
Differenzierung und enchondralen Ossifikation. Histologische Untersuchungen der mutanten
Knochen zeigten eine signifikante Verbreiterung und gestörte Orientierung der Wachstumsfugen
plus eine auffällige Verdickung des kortikalen Knochens. Diese Merkmale ähnelten
denen bei metaphysären Chondrodysplasien des Menschen – speziell vom Typ Jansen
(JMC). Dies implizierte eine Fehlregulation der Ihh/PTHrP Signalschleife, da eine Hyperaktivierung
des PTH/PTHrP-Rezeptors bei der JMC nachgewiesen wurde. Zusätzlich erschienen
in den Knochen der Mef2cloxP/KO Mäuse die Expressionsmuster von Col10a1, Ihh,
Pthr1 und Runx2 gestört und in ihrer Stärke reduziert.
Die Analyse regulatorischer Regionen in den Promotoren der Gene, die durch eine in vitro
Überexpression von Mef2c stimuliert wurden, enthüllte mögliche Mef2c Konsensussequenzen
in den Promotoren von Col10a1, Ihh, Ocn und Pthr1. In Reporterassays war Mef2c der
stärkste Aktivator von Col10a1 Reporterkonstrukten, während Pthr1 Reporterkonstrukte
synergistisch durch Mef2c, Runx2 und Sp1 aktiviert wurden. Im Gegensatz dazu zeigte
Mef2c einen inhibitorischen Effekt auf die Runx2 vermittelte Aktivierung eines Ocn Reporters.
PTH/PTHrP Signale sind bekannte Inhibitoren für die Expression von Col10a1 – in dieser
Arbeit konnte gezeigt werden, daß sie auch die p38 abhängige Phosphorylierung von
Mef2c in Chondrozyten reduzierten. Mutationen unterschiedlicher Posphorylierungsstellen
im Mef2c konnten jedoch die Regulation des Col10a1 Promotors durch PTHrP und p38
nicht aufheben. Interessanterweise führte ein Verlust der p38 und Erk5 spezifischen Phosphorylierungsstelle
an Position S387 zu einer erhöhten Aktivierbarkeit des Mef2c durch
p38. Damit wird die p38 abhängige Phosphorylierung von Mef2c durch PTHrP reguliert,
aber sie übt nur eine modulierende Rolle aus.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, daß Mef2c eine wichtige Rolle
in der enchondralen Ossifikation spielt und erlauben eine Positionierung von Mef2c innerhalb
der Ihh/PTHrP Signalschleife mit einer potentiellen Rolle bei der Regulation der Runx2
Expression und Funktion.
