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Language(s):
deu - German
Dates:
2009-11-01
Publication Status:
Accepted / In Press
Pages:
109
Publishing info:
Braunschweig : Technische Universität Braunschweig
Table of Contents:
Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................3
I. Abkürzungen .............................................................................................................3
II. Nukleotidbezeichnungen ....................................................................................................6
1. EINLEITUNG ..............................................................................................................7
1.1. Antikörper: Bildung, Struktur, Funktion ...................................................................7
1.2. Antikörper und ihre Rolle bei Autoimmunerkrankungen ......................................11
1.3. Next Generation Sequenzierung ................................................................................12
1.4. Bioinformatische Analyse von Antikörpergensequenzen ........................................14
1.5. Zielsetzung ...................................................................................................................16
2. MATERIAL .............................................................................................................................17
2.1. Experimenteller Teil .....................................................................................................17
2.1.1. Laborausstattung ....................................................................................................17
2.1.2. Verbrauchsmaterial .................................................................................................17
2.1.3. Chemikalien, Enzyme, Kit-Systeme, Lösungen, Puffer .........................................17
2.1.4. Primer .....................................................................................................................19
2.1.5. RNA- und cDNA-Proben .......................................................................................20
2.1.6. DNA-Längenstandards ...........................................................................................21
2.2. Bioinformatischer Teil .................................................................................................22
2.2.1. Hardware ................................................................................................................22
2.2.2. Software .................................................................................................................22
2.2.3. Internetquellen: Anwendungen und Datenbanken .................................................23
2.2.4. Antikörper-Sequenzen ............................................................................................23
2.2.5. Primer .....................................................................................................................24
3. METHODEN ...........................................................................................................................25
3.1. Experimenteller Teil .....................................................................................................25
3.1.1. DNA-Verdau und Reverse Transkription ...............................................................25
3.1.2. qRT-PCR ................................................................................................................26
3.1.3. Sequenzierungsvorbereitung ..................................................................................31
3.1.4. Polymerase-Kettenreaktion ....................................................................................35
3.1.5. Aufreinigung von PCR-Produkten .........................................................................37
3.1.6. DNA-Gelelektrophorese ........................................................................................38
3.1.7. Überblick der durchgeführten Experimente ...........................................................38
3.2. Bioinformatischer Teil .................................................................................................40
3.2.1. Unterschiedliche Vortests mittels Perl-Programme ...............................................40
3.2.2. Primer-Analysen .....................................................................................................41
3.2.3. VBASE2 „Statistic Analysis“ .................................................................................42
3.2.4. nextIGbase Datenbank ...........................................................................................42
3.2.5. Statistische Auswertung .........................................................................................42
4. ERGEBNISSE .........................................................................................................................43
4.1. Experimentelle Untersuchungen ...............................................................................43
4.1.1. Effizienz-Test und Kreuzreaktivitätstest der qRT-PCR-Primer ............................43
4.1.2. Mengenverhältnis zwischen IgG und IgD bei Gesunden und Patienten ................45
4.1.3. Einsatz von cDNA Pools ........................................................................................46
4.1.4. Ermittlung der cDNA Stoffmenge in den Proben ..................................................47
4.1.5. Vorbereitung der Next Generation Amplicon Sequenzierung ................................48
4.2. Bioinformatische Untersuchungen .............................................................................54
4.2.1. Genauigkeit der Identifizierung von V Genen in gekürzten Sequenzen und
Ermittlung der minimal erforderlichen Read-Länge ..............................................54
4.2.2. V-Gen-Analyse auf Nukleotid-Homopolymeren ...................................................57
4.2.3. Bestimmung der Cut Off Werte in den scFv-Testsequenzen ..................................59
4.2.4. Anzahl der durch Fw-Primer verursachten Mutationen
in den scFv-Testsequenzen .....................................................................................60
4.2.5. V-Gen-Coverage ....................................................................................................61
4.3. Auswertung der Next Generation Sequenzierdaten .................................................66
4.3.1. VBASE2 „Statistic Analysis“ und nextIGbase .......................................................66
4.3.2. Vergleich der Antikörpersequenzen zwischen Gesunden
und Autoimmunpatienten ......................................................................................67
5. DISKUSSION ..........................................................................................................................78
6. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................95
7. DANKSAGUNG .......................................................................................................................96
8. LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................................97
9. ANHANG ..............................................................................................................................102
Rev. Type:
-
Identifiers:
eDoc: 456277
Degree:
Diploma
