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Sprache(n):
deu - German
Datum:
2009-11-02
Publikationsstatus:
Angenommen
Seiten:
110
Ort, Verlag, Ausgabe:
Berlin : Freie Universität Berlin
Inhaltsverzeichnis:
1.Einleitung..........................................................................1
1.1. DPF3................................................................................................................1
1.2. DPF1 und DPF2.............................................................................................3
1.3. Chromatin-Struktur und Regulation der Genexpression..........................5
1.3.1. Histonmodifikationen................................................................................6
1.3.2. Plant Homeodomäne (PHD)......................................................................8
1.3.3. Chromatin Remodeling Komplexe..........................................................10
1.4. Dimerisierung von Transkriptionsfaktoren..............................................11
2. Zielstellung..........................................................................................................13
3. Material und Methoden.....................................................................................15
3.1. Chemikalien und Reagenzien......................................................................15
3.2. DNA Größenmarker....................................................................................16
3.3. Proteingrößenmarker..................................................................................17
3.4. Lösungen und Puffer...................................................................................17
3.5. Medien...........................................................................................................20
3.6. Bakterienmedien..........................................................................................20
3.7. Zellkulturmedium und Lösungen zum Arbeiten mit eukaryotischen Zellen...............................................................................................................20
3.8. Enzyme..........................................................................................................21
3.8.1. Restriktionsenzyme.................................................................................21
3.9. Primer...........................................................................................................22
3.10. Plasmide......................................................................................................22
3.11. Antikörper..................................................................................................23
3.12. Geräte und sonstige Materialien..............................................................23
3.13. Zellbiologische Methoden.........................................................................25
3.13.1. HEK293T Zellen...................................................................................25
3.13.2. Zellkulturarbeiten..................................................................................25
3.13.3. Auftauen der HEK293T Zellen.............................................................25
3.13.4. Kultivierung von HEK293T Zellen.......................................................26
3.13.5. Zellzahlbestimmung mit der Neubauer-Zählkammer............................26
3.13.6. Aussäen der HEK293T Zellen für die Transfektion..............................27
3.13.7. Transfektion der HEK293T Zellen mit Plasmid-DNA..........................27
3.13.8. Ernte der transfizierten HEK293T Zellen.............................................28
3.14. Molekularbiologische Methoden..............................................................28
3.14.1. Escherichia coli (E.coli) Stamm DH10B..............................................28
3.14.2. Transformation von hitzekompetenten E.coli (DH10B) mit Plasmid-DNA........................................................................................28
3.14.3. Übernachtkulturen von E.coli (DH10B)................................................29
3.14.4. Glycerinstocks von E.coli (DH10B)......................................................29
3.14.5. Plasmidisolierung von E.coli (DH10B)- Mini Preps.............................29
3.14.6. Plasmidisolierung von E.coli (DH10B)- Midi Preps.............................29
3.14.7. E.coli Stamm BL21prare3.....................................................................29
3.14.8. Transformation von hitzekompetenten E.coli (BL21prare3) mit Plasmid-DNA........................................................................................30
3.14.9. Vor- und Hauptkulturen von E.coli (BL21prare3)................................30
3.14.10. Expression von GST-Fusionsproteinen...............................................31
3.14.11. Bestimmung der optischen Dichte.......................................................31
3.14.12. PCR......................................................................................................31
3.14.13. Primerdesign........................................................................................33
3.14.14. Restriktionsverdau...............................................................................34
3.14.15. Dephosphorylierung der Vektor-DNA................................................34
3.14.16. Aufreinigung der DNA nach dem Restriktionsansatz.........................34
3.14.17. Ligation................................................................................................35
3.14.18. Re-Ligationstest...................................................................................35
3.14.19. Agarose-Gelelektrophorese.................................................................36
3.14.20. DNA Sequenzierung............................................................................36
3.15. Proteinbiochemische und immunologische Methoden...........................37
3.15.1. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.................................................37
3.15.2. Western Blot..........................................................................................38
3.15.3. Immunofluoreszenzfärbung...................................................................39
3.15.4. Bestimmung der Proteinkonzentration..................................................40
3.15.5. Aufreinigung der GST-Fusionsproteine................................................40
3.15.6. Elution der GST-Fusionsproteine..........................................................41
3.15.7. Pull-down...............................................................................................41
3.15.8. GST-Pull-down mit Sepharose..............................................................43
3.15.9. GST-Pull-down mit biotinylierten Histonpeptiden...............................43
4. Ergebnisse............................................................................................................45
4.1. Zusammenstellung der Proteinkonstrukte für den GST-Pull-down......45
4.2. Proteinaufreinigung und Überprüfung der Bindungseffizienz von GST-Fusionsproteinen an Glutathion-Sepharose................................................46
4.3. Überprüfung der Expression von Flag-Fusionsproteinen........................48
4.3.1. Überprüfung der Expression von Flag-Fusionsproteinen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western-Blot..............................48
4.3.2. Überprüfung der Expression von Flag-Fusionsproteinen mittels Immunofluoreszenzfärbung.....................................................................49
4.4. Untersuchung der Homo- und Heterodimerbildung von DPF3..............52
4.5. Charakterisierung der Dimerisierungsdomäne von DPF3......................54
4.6. Untersuchung der Interaktionen von DPF3 mit weiteren Mitglieder der d4-Proteinfamilie DPF1 und DPF2............................................................60
4.7. Zusammenfassung aller Interaktionspartner von DPF3b.......................61
4.8. Charakterisierung der Isoform DPF1d.....................................................62
4.8.1. Untersuchung des Vorhandenseins eines Exon 1 in der mRNA Sequenz der DPF1 Isoform d.................................................................................64
4.8.2. Untersuchung des PHD-Finger von DPF1d auf seine Fähigkeit zur Bindung von modifizierten Histonpeptiden............................................66
5. Diskussion............................................................................................................69
5.1. Rekombinante Proteine für GST-Pull-down Versuche............................69
5.2. Homo- und Heterodimerisierung von DPF3.............................................70
5.3. Identifizierung der Dimerisierungsdomäne von DPF3............................71
5.4. Interaktionen von DPF3 mit DPF1 und DPF2..........................................76
5.5. GST-Pull-down – Limitierungen................................................................77
5.6. Die Isoform DPF1d......................................................................................78
6. Zusammenfassung..............................................................................................81
7. Literaturverzeichnis...........................................................................................83
8. Abkürzungsverzeichnis......................................................................................87
9. Anhang.................................................................................................................89
9.1. Vergleich der Nukleotidsequenzen vier menschlichen
DPF1 Isoformen..........................................................................................89
9.2. Vergleich der vier humanen DPF1 Isoformen auf Proteinebene............93
9.3. Sequenzen der Transkripte von DPF3a und DPF3b................................94
Art der Begutachtung:
-
Identifikatoren:
eDoc: 451842
Art des Abschluß:
Diplom
