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Language(s):
deu - German
Dates:
2009-12-12
Publication Status:
Accepted / In Press
Pages:
101
Publishing info:
Berlin : Humboldt-Univesität Berlin
Table of Contents:
1 Einleitung ............................................................................................................................. 5
1.1 Das Herz ................................................................................................................ 5
1.2 Chromosomenorganisation und Regulation der Transkription ............................. 6
1.2.1 Histonmodifikationen ................................................................................... 7
1.2.2 Chromatin-Remodeling-Komplexe .............................................................. 9
1.2.2.1 Der BAF Chromatin-Remodeling-Komplex ............................................... 10
1.3 Der epigenetische Transkriptionsfaktor DPF3 .................................................... 12
1.4 Ziel der Arbeit ....................................................................................................... 15
2 Material und Methoden ..................................................................................................... 17
2.1 Material ................................................................................................................ 17
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien ................................................................... 17
2.1.2 Puffer und Lösungen ................................................................................. 19
2.1.3 Bakterienmedien ........................................................................................ 21
2.1.4 Medien und Lösungen für die Arbeit mit eukaryotischen Zellen ............... 22
2.1.5 Polyacrylamidgele zur Trennung von Proteingemischen.......................... 23
2.1.6 Enzyme ...................................................................................................... 23
2.1.7 Antikörper ................................................................................................... 24
2.1.8 Primer ......................................................................................................... 24
2.1.9 Vektoren ..................................................................................................... 25
2.1.9.1 N-TAP-Vektor ............................................................................................. 25
2.1.9.2 pGEX-3X-Vektor ........................................................................................ 25
2.1.9.3 Flag-Vektoren ............................................................................................ 26
2.1.10 Plasmide .................................................................................................... 27
2.1.11 Bakterienstämme ....................................................................................... 27
2.1.11.1 E. coli DH10B ............................................................................................. 27
2.1.11.2 E. coli BL21 prare3 .................................................................................... 28
2.1.12 Software ..................................................................................................... 28
2.1.13 Weitere Materialien und Geräte ................................................................ 28
2.2 Methoden ............................................................................................................. 29
2.2.1 Zellbiologische Methoden .......................................................................... 29
2.2.1.1 HEK293T-Zellen ........................................................................................ 30
2.2.1.2 Kultivierung und Passagierung von HEK293T-Zellen ............................... 30
2.2.1.3 Auftauen von HEK293T-Zellen .................................................................. 30
2.2.1.4 Aussähen von HEK293T-Zellen für eine Transfektion .............................. 30
2.2.1.5 Plasmid-Transfektion von HEK293T-Zellen mit PEI ................................. 31
2
2.2.1.6 Bestimmung der Zellzahl mit der Neubauer-Zählkammer ........................ 31
2.2.2 Molekularbiologische Methoden ................................................................ 31
2.2.2.1 PCR ............................................................................................................ 31
2.2.2.2 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren ............ 32
2.2.2.3 Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen........................................ 33
2.2.2.4 Aufreinigung von DNA ............................................................................... 33
2.2.2.5 Restriktionsverdau ..................................................................................... 33
2.2.2.6 Ligation ...................................................................................................... 34
2.2.2.7 Transformation von Plasmiden in E. coli DH10b ...................................... 35
2.2.2.8 Transformation von Plasmiden in E. coli BL21 prare3 für die Expression von GST-Proteinen ................................................................. 35
2.2.2.9 Dephosphorylierung von verdauter Vektor-DNA....................................... 35
2.2.2.10 Plasmidpräparation aus E. coli DH10b ..................................................... 35
2.2.2.11 Übernachtkulturen von E. coli DH10b für die Analyse von Klonen .......... 36
2.2.2.12 Vorkulturen von E. coli DH10b für die Plasmidisolation ........................... 36
2.2.2.13 Übernachtkulturen von E. coli DH10b für die Plasmidisolation ................ 36
2.2.2.14 Vorkulturen von E. coli BL21 prare3 für die Expression von GST-Proteinen .................................................................................................... 37
2.2.2.15 Hauptkulturen von E. coli BL21 prare3 für die Expression von GST-Proteinen .................................................................................................... 37
2.2.2.16 Bestimmung der OD600 von Bakteriensuspensionen ................................ 37
2.2.2.17 Glycerin-Stocks von Bakterienkulturen ..................................................... 37
2.2.2.18 DNA-Sequenzierungen .............................................................................. 38
2.2.3 Immunologische und proteinbiochemische Methoden.............................. 38
2.2.3.1 Expression von GST-Fusionsproteinen in E. coli BL21 prare3 ................ 38
2.2.3.2 Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen .................................................. 38
2.2.3.3 Gewinnung von Proteinextrakten aus HEK293T-Zellen für Pulldown-Assay ......................................................................................................... 39
2.2.3.4 In vitro Translation ..................................................................................... 39
2.2.3.5 GST-Pulldown-Assay ................................................................................ 39
2.2.3.6 Die TAP-Methode ...................................................................................... 41
2.2.3.7 TCA-Fällung von Proteinen ....................................................................... 43
2.2.3.8 SDS-PAGE ................................................................................................ 43
2.2.3.9 Western Blot .............................................................................................. 43
2.2.3.10 Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford .............................. 44
2.2.3.11 Immunfluoreszenz-Färbung von HEK293T-Zellen ................................... 45
3 Ergebnisse.........................................................................................................................47
3.1 Analyse von DPF3-Deletionskonstrukten mit der TAP-Methode ........................ 47
3.1.1 Klonierungen in den N-TAP-Vektor ........................................................... 49
3
3.1.2 Expression von Fusionsproteinen in HEK293T-Zellen ............................. 50
3.1.3 Aufreinigung von TAP-Fusionsproteinen .................................................. 51
3.1.4 Bindungsverhalten von aufgereinigten TAP-Fusionsproteinen ................ 53
3.2 Untersuchung der direkten Bindung von DPF3 an den BAF-Komplex .............. 54
3.2.1 Expression von Flag-Fusionsproteinen in HEK293T-Zellen ..................... 55
3.2.2 In vitro Translation von Flag-Fusionsproteinen ......................................... 56
3.2.3 Expression von GST-Fusionsproteinen in E. coli BL21 prare3 ................ 56
3.2.4 GST-Pulldown mit HEK293T-Proteinextrakten ......................................... 57
3.2.5 GST-Pulldown mit in vitro translatierten Flag-Proteinen ........................... 58
3.3 Analyse von DPF3-Deletionskonstrukten mittels GST-Pulldown ....................... 59
3.3.1 Klonierungen in den pGEX-3X-Vektor ...................................................... 60
3.3.2 Expression von Flag- und GST-Fusionsproteinen .................................... 60
3.3.3 GST-Pulldown mit DPF3-Deletionskonstrukten ........................................ 60
3.4 Sequenzanalyse .................................................................................................. 62
3.4.1 Konservierung der Brg1-Bindebereiche .................................................... 62
3.4.2 Suche nach konservierten Domänen und Motiven ................................... 66
4 Diskussion ......................................................................................................................... 69
4.1 Untersuchung der direkten Bindung von DPF3 an den BAF-Komplex .............. 69
4.2 Charakterisierung der BRG1/DPF3-Bindung ...................................................... 71
4.3 Assoziation von HEY1 mit dem BAF-Komplex ................................................... 76
5 Zusammenfassung ............................................................................................................ 79
6 Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... 81
7 Referenzen ........................................................................................................................ 85
8 Anhang .............................................................................................................................. 91
8.1 Aminosäuresequenzen von DPF3 ....................................................................... 91
8.2 Alignment von humanem und murinem BRG1 und BAF60c .............................. 91
9 Eigenständigkeitserklärung ............................................................................................... 95
Rev. Type:
-
Identifiers:
eDoc: 451720
Degree:
Diploma
