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Abstract:
Zusammenfassung
Eine Bestimmungsmethode für extrazelluläre mikrobielle Enzymaktivitäten, die für ökologische Untersuchungen aquatischer Biotope eingesetzt werden soll, muß bestimmten Ansprüchen genügen. Die nachzuweisenden extrazellulären Aktivitäten werden durch eine Mischung verschiedener Enzyme und Isoenzyme mit jeweils extrem kleinen Konzentrationen verursacht. Fluorigene Modellsubstrate zum Nachweis von Enzymaktivitäten zeichnen sich durch ihre große Empfindlichkeit aus. Sie erlauben daher die Messung der geringen extrazellulären mikrobiellen Aktivitäten, die in aquatischen Biotopen auftreten. Für den Meßvorgang selber sind nur kurze Inkubationszeiten von wenigen Stunden erforderlich, so daß die Enzymaktivitäten annähernd unter in situ Bedingungen nachgewiesen werden können. Fluorigene Modellsubstrate werden aufgrund dieser Vorteile gegenüber anderen Nachweismethoden häufig zur Bestimmung von mikrobiellen extrazellulären Enzymen eingesetzt.
In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob diese inzwischen zum Nachweis vieler verschiedener Enzyme angebotenen Modellsubstrate tatsächlich jeweils spezifisch nur durch die Enzyme gespalten werden, deren Aktivität gemessen werden soll. Diese Eigenschaft wäre wichtig, um in dem Gemisch verschiedener Enzyme die einzelnen Aktivitäten gezielt bestimmen zu können. Die Umsetzungen einer Reihe bei ökologischen Untersuchungen häufig eingesetzter Modellsubstrate durch verschiedene käufliche Enzympräparate wurden zu diesem Zweck verfolgt und die kinetischen Parameter bestimmt. Durch die Kombination acht verschiedener Modellsubstrate mit ebensovielen Enzympräparate konnten 64 unterschiedliche Enzymreaktionen beobachtet werden. Bei zehn dieser Reaktionen handelte es sich um die theoretisch spezifischen Umsetzungen durch die betreffenden Enzyme. Die kinetischen Messungen der Reaktionen der 54 anderen Enzym-Substrat-Kombinationen zeigten in 16 Fällen unspezifische Spaltungen. Betroffen davon waren fünf der acht untersuchten Modellsubstrate. Der Vergleich der kinetischen Parameter dieser unspezifischen Umsetzungen mit denen der spezifischen Enzymreaktionen zeigte jedoch, daß nur bei fünf der unspezifischen Spaltungen die Reaktionsgeschwindigkeit bzw. die Affinität des Enzyms zum Substrat ausreichte, um die Möglichkeit des gezielten Nachweises von Enzymaktivitäten beeinträchtigen zu können.
Es wurde weiterhin versucht, durch die Zugabe von Enzymhemmstoffen das Ausmaß der unspezifischen Spaltungen zu begrenzen. Nur in einem Fall (Spaltung von MUF-β-Galactosid durch β-Glucosidase) konnte die Michaelis-Konstante durch den Inhibitor signifikant gesteigert werden.
Die Frage: "Wie spezifisch sind Methylumbelliferyl-Verbindungen?" kann anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zumindest tendenziell beantwortet werden. Bei der großen Mehrheit der getesteten Enzym-Substrat-Kombinationen (90 %) konnten entweder keine oder nur sehr geringe unspezifische Reaktionen gemessen werden. Die Substrate MUF-α-Glucosid, MUF-β-Glucosid, MUF-Phosphat und Leucin-Cumarinylamid können normalerweise bei Untersuchungen von Gewässern als hinreichend spezifisch angesehen werden. Das Auftreten der Spaltungen von drei Modellsubstraten (MUF-Butyrat, MUF-β-Galactosid und MUF-Phosphat-Natrium-Salz) durch diese Substrate theoretisch nicht spaltende Enzyme in relativ großem Ausmaß zeigt jedoch, daß in einigen Fällen der gezielte Nachweis von Enzymaktivitäten nicht bedenkenlos möglich ist. Allerdings kann der in der hier durchgeführte relative Vergleich von spezifischen mit unspezifischen Umsetzungen nur ein Anhaltspunkt für im ungünstigsten Fall auftretende Ungenauigkeiten sein. Weiterführende quantitative Untersuchungen sind in diesem Zusammenhang nötig, um genauere Aussagen machen zu können.
