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要旨:
Das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ist ein abgeschwächtes Virus, welches sich nicht in
humanen Zellen replizieren kann. Deswegen war es in der Vergangenheit ein geeignetes Werkzeug zur
Immunisierung gegen Pocken. Die große Wirtsspezifität des Virus hat zur Folge, dass eine Replikation
vorwiegend in aviären Zellen, wie z.B. der durch ProBioGen AG in Kooperation mit IDT Biologika
GmbH entwickelten Designerzelllinie AGE1.CR.pIX möglich ist. Aufgrund der genannten Eigenschaften
dient MVA heutzutage als genetischer Vektor in der molekularbiologischen Forschung, aber auch
weiterhin als Impfstoff gegen die Pockenkrankheit.
Die Quantifizierung aktiver Viruspartikel ist ein entscheidendes Element bei der Untersuchung der
Replikationsdynamik. Bisher konnte die Viruskonzentration ausschließlich über ein sehr kosten- und zeitintensives
Verfahren (TCID50-Test) bestimmt werden. Ausgangspunkt und Fragestellung dieser Arbeit war
u.a. die Annahme, dass die Messung der Fluoreszenz infizierter Zellen potentiell eine alternative Methode
der Virustiterermittlung darstellt. Vor allem aber stand die zuverlässige Identifikation infizierter Zellen am
Durchflusszytometer im Vordergrund. Zu diesem Zweck wurde für die Experimente das rekombinante
MVA-egfp Virus eingesetzt.
Die folgende Arbeit zeigt die Daten zur Infektion der AGE1.CR.pIX-Zellen mit MVA und dem
rekombinanten MVA-Stamm (MVA-egfp). Hierbei erreichte das rekombinante Virus in den Zellen
vergleichbare Titer zu denen des Wildtyps. Maximale Titer von 5,6*108 Viren/mL (MVA) und 3,2*108
Viren/mL (MVA-egfp) wurden ca. 50 Stunden nach der Infektion erreicht. In weiterführenden
Infektionsstudien konnte zudem gezeigt werden, dass sowohl die multiplicity of infection (moi), die
Medienzusammensetzung als auch das Kultivierungssystem selbst entscheidenden Einfluss auf die
Virusproduktion hatte. Optimale Bedingungen für die MVA-Replikation waren demnach ein
Medienverhältnis (CD-VP4 : CD-U2) von 1:1, eine moi von 0,05 und die Kultivierung in
Schüttelkolbensystemen. Kultivierung im Rührkesselreaktor DasGip® lieferten einen Anteil infizierter
Zellen von 43 %, DasGip® Dunkelkultivierungen 86 % und im Schüttelkolben konnten 52 % der Zellen
infiziert werden. Zusätzlich wurden Virusproben unter dem Laser Scanning Mikroskop untersucht, um
die Ergebnisse des Durchflusszytometers zu bestätigen.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Infektionsstudien lassen AGE1.CR.pIX als robuste Produktionszelllinie
für MVA erkennen. Allerdings lieferten die Ergebnisse der Titerbestimmungen mittels TCID50
und dem Durchflusszytometer keine statistische Korrelation. Zukünftig ist es daher unerlässlich,
weiterführende Fluoreszenzmessungen durchzuführen, um so die Virusquantifizierung zu erleichtern und
den analytischen Aufwand zu verringern. Zuverlässig konnte aber der Anteil infizierter Zellen an der
Gesamtpopulation bestimmt werden. Eine Einbindung der erhobenen Daten in ein mathematisches
Modell ist somit möglich und bildet die Grundlage für ein umfassenderes Verständnis von MVA
Infektionen.
