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要旨:
In dieser Arbeit wurde ein quarzgestütztes Modellsystem zur Untersuchung von Membranproteinen mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (ESR-Spektroskopie) studiert.
Dieses Modellsystem besteht aus einer quarzgestützten Lipiddoppelschicht (Lipidfundament), an die das zu untersuchende Membranprotein Holorhodopsin (HR), das in mizellarer
Form vorliegt, gebunden wird. Die Verankerung des HR auf der Lipidoberfläche erfolgt über ein HisTag am Protein, das an im Lipidfundament befindliche Ni-NTA-Lipide bindet.
Abschließend wird das so verankerte HR in eine Lipiddoppelschicht rekonstituiert.
Ziel dieser Herangehensweise ist es, ein Modellsystem zu erhalten, das als festkörpergestützte Zellmembran mit integrierten Proteinen aufgefasst werden kann. Mit Hilfe der ESR-Spektroskopie können die einzelnen Komponenten des Modellsystems unabhängig voneinander untersucht werden. Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erzielt:
Die zum Lipidfundament durchgeführten Untersuchungen führten zu neuen Erkenntnissen über quarzgestützte Lipiddoppelschichten. So stellte sich heraus, dass der Austausch von Lipiden zwischen dem Fundament und in Suspension befindlichen Lipidvesikeln über
Filmdefekte vonstattengeht. Die Lipidzusammensetzung der obersten Lipidmonolage des Fundaments entspricht nach erfolgtem Austausch der Zusammensetzung der Vesikel. Auf
Basis dieser Ergebnisse war es möglich, eine neue Modellvorstellung zu entwickeln, mit
deren Hilfe auch veröffentlichte Untersuchungen zu diesem Thema schlüssig gedeutet werden können.
Die Verankerung des Halorhodopsins auf dem Lipidfundament zeigte, dass die HR-Detergenz-
Mizellen nicht ausschließlich über die Lipidanker im Fundament an die Oberfläche
gebunden werden. Vielmehr wechselwirkt das Lipidfundament mit den Mizellen
und bewirkt eine zusätzliche Bindung an die Oberfläche. Rekonstituiert man das HR in eine
Lipiddoppelschicht, tritt diese zusätzliche Wechselwirkung nicht mehr auf.
Die Versuche, zwischen den verankerten HR-Mizellen eine Lipiddoppelschicht aufzubauen, zeigten, dass keine planare Membran herausgebildet wird. Gibt man Lipidvesikel zu den verankerten HR-Mizellen, so wird das HR in diese Vesikel rekonstituiert. Auf diese Weise werden die Lipidvesikel über die verankerten Membranproteine an die Oberfläche gebunden.
Neben den Untersuchungen zum quarzgestützten Modellsystem fanden in Kooperation mit der AG Hegemann (Humboldt-Universität zu Berlin) erste ESR-Untersuchungen an Channelrhodopsin
2 (ChR2) statt. Das ChR2 lag ebenfalls in Form von Protein-Detergenz-Mizellen vor. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass das Anbringen der Spinsonde MTSSL zum Verlust der Funktionsfähigkeit des ChR2 führt. Als der wahrscheinlichste Verursacher konnte das Cystein C208 identifiziert werden. Die Funktionsrelevanz dieses Cysteins in Verbindung mit der Tatsache, dass es in allen Channelrhodopsinen konserviert
ist, nicht aber in Rhodopsinpumpen wie Halorhodopsin und Bakteriorhodopsin, lassen weiterführende Untersuchungen zum C208 lohnenswert erscheinen.
Um zukünftig die zu untersuchenden Membranproteine nicht mehr über ein Lipidfundament verankern zu müssen, wurde ein halbzylindrischer Hohlraumresonator entwickelt.
Dieser erlaubt die ESR-spektroskopische Untersuchung von metallgestützten Systemen.
