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キーワード:
huntingtin, aggregation, polyglutamines, nuclear proteins
要旨:
Chorea Huntington (HD) ist eine progressiv verlaufende, autosomal dominant vererbte neurodegenerative Krankheit. Sie wird durch eine überlange Polyglutamindomäne im N-Terminus des Huntingtin- Proteins verursacht. Sowohl der Krankheitsmechanismus als auch die Funktion von Huntingtin sind bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt. Es wurde gezeigt, dass Huntingtin Exon 1 Proteine mit pathologischen Polyglutamindomänen (>37 Glutaminen) in vitro unlösliche Proteinaggregate mit fibrillärer Struktur bilden. Außerdem wurden Einschlusskörper mit aggregiertem Huntingtin-Protein in Gehirnen von transgenen Mäusen und von HD Patienten nachgewiesen. Dies führte zur Hypothese, dass die Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten bei der Entstehung der Krankheit eine wichtige Rolle spielen könnte. In dieser Arbeit wurde die Coaggregation von Huntingtin Exon 1 Proteinen mit anderen polyglutaminhaltigen Proteinen im Detail untersucht. Mittels Affinitätschromatographie wurden mit myc- bzw. FLAG-Sequenzen markierte GST-Huntingtin Exon 1-Fusionsproteine mit Polyglutamindomänen im normalen (20-32 Glutaminen) und pathologischen Bereich (37-54 Glutaminen) gereinigt. Diese Proteine können auf Grund der Epitopmarkierung mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden. Nach der proteolytischen Abspaltung des GST-Anteils bildeten die freigesetzten Huntingtin Exon 1-Proteine mit überlangen Polyglutamindomänen unlösliche Proteinaggregate, während die Proteine mit einer Polyglutamindomäne im normalen Bereich nicht aggregierten. Huntingtin-Aggregate wurden durch einen keimabhängigen Prozess gebildet und haben eine fibrilläre Struktur. Die Fibrillogenese folgt dabei einer Kinetik erster Ordnung. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass immunogold markierte Huntingtin Exon 1-Proteine mit unterschiedlich langen Polyglutaminsequenzen in vitro koaggregieren. In Gegensatz dazu bildeten die polyglutaminhaltigen Proteine TBP (TATA-binding protein) und NOCT3 (nerval octamer binding factor 3) mit den Huntingtin-Proteinen keine SDS-resistenten Coaggregate. Das deutet darauf hin, dass die Bildung von polyglutaminhaltigen Proteinaggregaten ein hoch spezifischer Prozess ist. Die Ergebnisse in vitro wurden mit HD Zellkulturmodellsystemen bestätigt. In Säugetierzellen wurde eine Colokalisation von Huntingtin mit den Proteinen TBP, NOCT3 und PQBP1 (polyglutamine binding protein 1) nachgewiesen. Diese Proteine bildeten mit Huntingtin jedoch keine SDS-stabilen Coaggregate. Eine Colokalisation von mutiertem Huntingtin und den Proteinen NOCT3 und PQBP1 wurde auch in den Nervenzellen von HD transgenen Mäusen detektiert, was darauf hindeutet, dass eine Rekrutierung von Proteinen in polyglutaminhaltige Proteinaggregate eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit spielt.
