Isolierung und Charakterisierung exprimierter Sequenzen im Bereich des MID1 Gens

Lehmann, Tanja

Isolierung und Charakterisierung exprimierter Sequenzen im Bereich des MID1 Gens

Lehmann, T. (2003). Isolierung und Charakterisierung exprimierter Sequenzen im Bereich des MID1 Gens. PhD Thesis, Medizinische Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin, Berlin.

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資料種別: 学位論文

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Lehmann, Tanja¹, 著者

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1Max Planck Society, ou_persistent13

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言語: deu - German

日付: 受理: 2003

出版の状態: 受理 / 印刷中

ページ: 87 S.

出版情報: Berlin : Medizinische Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

目次: 1 Einleitung ............................... 6
1.1 Opitz Syndrom .......................... 6
1.2. Embryologie............................ 7
1.3 Das MID1-Gen ........................... 9
1.3.1 Klonierung, genomische Anordnung...... 9
1.3.2 Proteinfamilie ...................... 10
1.3.3 Mutationsanalysen.................... 11
1.3.4 Konservierung von MID1 in der Maus .. 12
1.3.5 Expression des MID1-Gens ............ 12
1.3.6 Funktion des MID1-proteins.............................. 13
1.4 Wachstumsfaktoren...................... 13
1.5 Fugu rubripes als Modellorganismus .... 14
1.6 Fragestellung und Zielsetzung................................ 15
2 Material und Methoden ................... 16
2.1 Material .............................. 16
2.1.1 Medien und Puffer ................... 16
2.1.2 Restriktionsenzyme .................. 17
2.1.3 Vektoren............................. 18
2.1.4 Primer .............................. 18
2.1.4.1 Primersequenzen im Fugu-Cosmid................................ 18
2.1.4.2 Primersequenzen in humaner MID1-cDNA.................................. 19
2.1.4.3 andere Primersequenzen............. 20
2.1.5 Zellinien ........................... 21
2.2 Methoden .............................. 22
2.2.1 Elektrophoresetechniken ............. 22
2.2.1.1 Horizontalgelelektrophorese........ 22
2.2.1.1.1 DNA-Agarose-Gelelektrophorese.... 22
2.2.1.1.2 RNA-Elektrophorese denaturierend.)............................ 22
2.2.1.2 Vertikalgelelektrophorese: Sequenzgel ........................................... 22
2.2.2 Nukleinsäuren Präparation ........... 23
2.2.2.1 Cosmid Präparation................. 23
2.2.2.2 Genomische DNA-Isolierung ......... 23
2.2.2.2.1 Aus Zellinien ................... 23
2.2.2.2.2 Aus Geweben ..................... 24
2.2.2.3 Plasmid-DNA-Isolierung............. 24
2.2.2.4 DNA-Isolierung aus Agarose ........ 24
2.2.2.5 Aufreinigung von PCR-Produkten .... 24
2.2.2.6 Total RNA-Isolierung................24
2.7 Poly-A+ RNA-Isolierung ................ 25
2.2.3 Klonierungstechniken ................ 25
2.2.3.1 Herstellung DH5a kompetenter Zellen E. coli ........................................... 25
2.2.3.2 Ligation -......................... 25
2.2.3.2.1 Dephosphorylierung des Vektors .. 25
2.2.3.2.2 Ligation „Sticky Ends“...................................... 26
2.2.3.2.3 Ligation „Blunt End“....................................... 26
2.2.3.2.4 TA-Klonierung für PCR-Produkte............................... 26
2.2.3.3 Transformation......................26
2.2.3.4 Restriktionsverdau................. 27
2.2.3.5 Deletionsklonierung................ 27
2.2.4 Polymerase Kettenreaktion (PCR)...... 28
2.2.4.1 Standard-PCR....................... 28
2.2.4.2 Long-Distance-PCR ................. 28
2.2.4.3 RT-PCR ............................ 29
2.2.4.4 5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ........................................... 29
2.2.4.5 3’RACE ............................ 31
2.2.4.6 DNA Sequenzierung.................. 31
2.2.4.6.1 Sequenzreaktion.................. 31
2.2.4.6.2 Sequenzierung von Plasmiden...... 32
2.2.4.6.3 Sequenzierung von PCR-Produkten.. 32
2.2.4.6.4 Primer-Walking................... 32
2.2.5 Transfertechniken ................... 32
2.2.5.1 Southern Blot...................... 32
2.2.5.1.1 Trockenblot ..................... 32
2.2.5.1.2 Naßblot ......................... 33
2.2.5.2 Northern Blot ..................... 33
2.2.6 Hybridisierungstechniken ............ 34
2.2.6.1.1 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA Sonden (1) ................................ 34
2.2.6.1.2 Markierung und Aufreinigung radioaktiver DNA-Sonden (2)............................. 34
2.2.6.2 Hybridisierung von Southern Blots...................................... 34
2.2.6.3 Hybridisierung von Northern Blots, Schnellhybridisierung ..................... 35
2.2.6.4 Autoradiographie .................. 35
2.2.6.5 Herstellung von Hybridisierungsproben ........................................... 35
2.2.7 Zellkultur........................... 36
2.2.7.1 Umsetzen von Zellinien ............ 36
2.2.7.2 Einfrieren von Zellinien .......... 36
2.2.7.3 Auftauen von Zellkulturen ......... 36
2.2.7.4 Ernten von Zellen ................. 36
2.2.7.5 Wachstumsfaktor-Stimulationsessay . 37
2.2.8 Computerprogramme ................... 38
2.3 Abkürzungen ........................... 38
3 Ergebnisse .............................. 39
3.1 Arbeitsplan ........................... 39
3.1.1 Suche nach neuen exprimierten Exons...................................... 39
3.1.2 Charakterisierung der MID1-Transkriptionsregulation ........................................... 39
3.2 MID1-Ortholog bei Fugu rupripes........ 40
3.2.1 Cosmidauswahl........................ 40
3.2.2 Cosmidsequenzierung.................. 41
3.2.3 Cosmidanalyse........................ 44
3.3.1 Nukleotidebene ...................... 44
3.3.2 Proteinebene......................... 44
3.4 Untersuchung der Exonvorhersagen ...... 49
3.4.1 Zoo-Blot Untersuchungen ............. 54
3.5 Promoteranalyse ........................................... 57
3.6 Humane MID1-Transkription ............. 58
3.6.1 Modellsystem: Zellinie 18/98 ........ 58
3.6.2 Suche nach neuen exprimierten Sequenzen.................................. 58
3.6.2.1 ORF................................ 58
3.6.2.2 3’UTR.............................. 60
3.6.2.3 5’UTR.............................. 61
3.6.3 Charakterisierung der MID1-Transkriptionsregulation ........................................... 62
3.6.3.1 Expressionsstudien .................62
3.6.3.2 Charakterisierung der MID1-Transkripte ........................................... 63
3.6.4 MID1-Transkription bei OS-Patienten.. 64
3.6.4.1 OS-Patient 5174 ................... 64
3.6.4.2 OS-Patient 165/98 ................. 66
3.7 MID1 und Wachstumsfaktor TGF-beta3 .... 70
3.7.1 MID1-Transkription und TGF-beta3 .... 70
3.7.2 TGF-beta3 spezifische MID1-Regulation bei OS-Patient 165/98 .................................... 71
4 Diskussion .............................. 72
4.1 Suche nach exprimierten Sequenzen ..... 72
4.1.1 Das Fugu MID1-Ortholog .............. 72
4.1.2 Fugu-Exons .......................... 73
4.2 Regulationsstudien auf Transkriptionsebene ........................................... 75
4.2.1 MID1-Transkription................... 76
4.2.2.1 Regulatorische Elemente des MID1-Gens.................................. 76
4.2.3 MID1-Transkription in OS-Patienten...................... ........ 77
4.2.3.1 MID1-Transkription - OS-Patient 5174 ........................................... 77
4.2.3.2 MID1-Transkriptionsregulation - OS-Patient 165/98 ........................................... 78
4.2.4 MID1-Promoter ....................... 79
4.3 Ausblick .............................. 80
5 Zusammenfassung ......................... 82
6 Literatur................................ 83

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識別子（DOI, ISBNなど）: eDoc: 194767

学位: 博士号 (PhD)

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