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キーワード:
Ribosome; Antibiotics; Termination; Aminoglycosides
要旨:
Parameter zweier in vitro Systeme zur Analyse der Proteinsynthese in E. coli wurden analysiert und verbessert. Die optimierten Systeme wurden zum Studium ausgesuchter Antibiotika und ihrer Hemmechanismen, sowie zur Funktionsanalyse der Ribosomenfaktoren LepA, RelA und der Terminationsfaktoren RF2 und RRF angewendet. Ferner wurde die toeprint Methode zur Bestimmung der Ribosomenposition auf einer speziell entworfenen mRNA unter in vivo nahen Bedingungen eingeführt. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: 1. Wir optimierten unser Standard Poly(U) abhängiges Poly(Phe) System zu einem robusten in vitro System und erzielten statistisch 100 bis 300 eingebaute Phenylalaninreste per Ribosom mit nicht fraktionierten Poly(U) bzw. 800 bis 1000 eingebaute Phenylalaninreste per Ribosom mit Poly(U)-Ketten von 1400 Nukleotiden. Dieses System zeichnet sich durch folgende Merkmale aus: (i) Die Konzentration von 4,5 mM Mg2+ erscheint optimal gemessen an Syntheseleistung und -genauigkeit. (ii) Der hohe Phenylalanin-Einbau erlaubt eine genaue Messung der Fehlerrate mit einer Auflösungsgrenze von 1:10000 (ein Fehleinbau per 10000 eingebauten Phenylalaninen). Das System weist einen Fehleinbau von etwa 1:3000 bezüglich der nah-verwandten Aminosäure Leucin auf, was der in vivo Genauigkeit entspricht. (iii) Signifikanten Fehleinbau konnten nur für Fehlpaarungen in der „wobble“ Position des Codons (dritte Codonposition), jedoch nicht in der mittleren Position und kaum in der ersten Position des A-Stellen Codons beobachtet werden. Dies gilt auch dann, wenn der Fehleinbau um einen Faktor von 20 bis 30 durch Streptomycin oder durch eine Erhöhung der Mg2+-Konzentration verstärkt wurde. Diese Beobachtung führte zu einer genaueren Definition der Begriffe kognat, nah-kognat und nicht-kognat über die Wahrscheinlichkeit des Fehleinbaus und die damit gekoppelten dramatischen Unterschiede in dem GTP Verbrauch, im Gegensatz zu der bisher vorherrschenden, zu simplen Betrachtung der Fehlpaarungen (Szaflarski und Vesper et al. Publikation in Vorbereitung). Des weiteren konnten wir in diesem System ein nicht-enzymatisches Recycling der Ribosomen nachweisen und eine Recyclingzeit von ca. 300 Sekunden bestimmen. 2. Die Einführung der toeprint Methode in den Methodenpool der Arbeitsgruppe war - in Kombination mit der Puromycinreaktion – entscheidend für die Entdeckung einer neuen ribosomalen Funktion eines in unserer Gruppe entdeckten ribosomalen Elongationsfaktors, des Proteins LepA, welches zu den konserviertesten Proteinen überhaupt gehört und den wir vorschlagen EF4 zu nennen. Die neue Funktion von EF4 ist überraschenderweise eine Rücktranslokation der tRNAs von E- und P- Stellen in die P- und A- Stellen während der Elongation, was offenbar zur Steigerung der Genauigkeit der Proteinsynthese unter Stressbedingungen von großer Bedeutung ist. Das konnten wir in zwei verschiedenen gekoppelten Transkriptions-/Translationssystemen belegen. 3. Widersprüchliche Daten zu den bekannten Aminoglykosid-Effekten auf die A-Stellen Besetzung konnten aufgelöst werden. Insbesondere haben wir festgestellt, dass einige Aminoglykoside eine Rücktranslokation des Ribosoms auslösen können (jedoch nicht das Aminoglykosid Hygromycin), während andere, nicht-verwandte Antibitotika wie Viomycin und Edein ebenfalls einen starken Rücktranslokationseffekt aufweisen. 4. Für Pilotexperimente zur Analyse der Termination und des Ribosomenrecyclings konnten in vitro Systeme etabliert werden. Der wichtigste Befund war, dass die E-tRNA Entlassung durch die Terminationsfaktoren der Klasse 1 (hier RF2) und nicht durch RRF, ein Faktor der Klasse 2, ausgelöst wird, eine Fragestellung, die bislang nicht bearbeitet werden konnte.
