ausblenden:
Schlagwörter:
-
Zusammenfassung:
Zusammenfassung
Das Ziel dieser Arbeit war die Optimierung des SELEX- Verfahrens gegen kleine Moleküle.
SELEX steht dabei für Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment. Dies ist
eine Methode zur in-vitro Selektion von Aptameren. Diese kurzen Oligonukleotide werden
aus einer Nukleinsäurebank heraus gegen Moleküle selektiert. In einem iterativen Zyklus
werden Aptamere generiert, welche die Zielmoleküle spezifisch und mit hoher Affinität
binden.
Es sollten, sowohl DNA- als auch RNA-Aptamere gegen Histamin und Folsäure sowie gegen
die Phytohormone Gibberellinsäure und Indol-3-essigsäure selektiert werden.
Eindeutige Ergebnisse der DNA-SELEX konnten innerhalb der Zeitspanne dieser Arbeit nicht
erreicht werden. Jedoch konnten die angereicherten Nukleinsäuresequenzen der RNASELEX
mit der SOLEXA-Technologie von Illumina sequenziert werden. Es konnten mögliche
Aptamer-Sequenzen für Gibberellinsäure und Histamin identifiziert werden, die spezifisch für
ihr Zielmolekül sind und mit großer relativer Häufigkeit in dem Nukleinsäurepool vorkommen.
Zusätzlich wurden ebenfalls die Sekundärstrukturen von ausgesuchten Sequenzen mit mfold
berechnet. Die Strukturen zeigten große Übereinstimmungen. Alle analysierten Sequenzen
besitzen Haarnadelstrukturen, mit denen die Zielmoleküle möglicherweise in die
Aptamerstruktur integriert werden.
Ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit war die Optimierung der SELEX-Methode. Durch die
halbautomatische Durchführung der DNA-SELEX mit dem Magnetpartikelprozessor
„KingFisher Flex“ von Thermo Scientific konnte der Zeit- und Arbeitsaufwand minimiert
werden. Auch konnte somit eine bessere Reproduzierbarkeit erreicht werden.
Durch die Amplifizierung der selektierten Nukleinsäurefragmente der RNA-SELEX mit der
RNA-abhängigen Q-Beta RNA-Polymerase war es nicht notwendig, die RNA-Aptamere in
cDNA zu transkribieren. Dies wiederum bedeutet die Einsparung zweier enzymatische
Schritte und somit ebenfalls eine Zeitersparnis und die Reduktion von möglichen Fehlern
während der Transkription.
Das Protokoll der Q-Beta Replikation konnte von vier auf drei Stunden Inkubationszeit
verkürzt werden, da festgestellt wurde, dass auch innerhalb von drei Stunden ausreichend
RNA repliziert wird. Durch die Reduzierung der Selektionsrunden von 10 bis 15 auf drei, und
die verwendete SOLEXA-Sequenzierung, konnte die Dauer der SELEX von 10 bis 45 Tagen
auf vier Tage verkürzt werden.
Des Weiteren wurden drei aufeinander folgende Replikationen einer Nukleinsäurebank mit
der Q-Beta Replikase durchgeführt. In einem Diversitätsassay dieser Replikationen konnte
II
gezeigt werden, dass die Q-Beta RNA-Polymerase bestimmte Sequenzen einer
Nukleinsäurebank bevorzugt amplifiziert. Dies könnte bedeuten, dass selektierte RNAAptamere
in der Q-Beta Amplifikation nicht ausreichend repliziert werden und so während
der SELEX verloren gehen. Allerdings könnten mit diesem Experiment neue
Strukturelemente der RNA gefunden werden, welche zu einer effizienten Q-Beta Replikation
führen.
In dieser Arbeit konnten einzelne Arbeitsschritte der SELEX-Methode verkürzt werden.
Aufbauend auf die Ergebnisse kann die Selektion von Aptameren mit geringerem Arbeitsund
Zeitaufwand durchgeführt werden.