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要旨:
Zusammenfassung
Fluorigene Modellsubstrate eignen sich gut zur Bestimmung mikrobieller extrazellulärer Enzymaktivitäten. Sie bieten den Enzymen die Bindung zur Spaltung an, die diese unter natürlichen Bedingungen spalten würden. Wird diese Bindung aufgetrennt, wird ein fluoreszierender Stoff frei, der quantitativ im Fluorimeter bestimmt werden kann und als Maß für die enzymatische Aktivität dient.
Diese Methode fand Verwendung für die vorliegende Arbeit. Es sollte geklärt werden, wo die Bestimmungsgrenzen für die Bestimmung der extrazellulären Aktivität für die drei Enzyme β-D-Glucosidase, Phosphatase und Leucin-Aminopeptidase liegen. Dafür wurden unterschiedliche Wasserproben, u.a. Grund-, Bach-, Quell-, Tiefbrunnen- und Trinkwasser aus Proben in Schlitz auf ihre Bestimmbarkeit hin untersucht. Zusätzlich wurden Wasserproben in der Trinkwassergewinnungsanlage Hengsen der Dortmunder Stadtwerke in Schwerte bearbeitet, weil in einer derartigen Anlage im Ablauf der einzelnen Reinigungsschritte sehr hohe und sehr niedrige Enzymaktivitäten zu erwarten waren. Über die Dauer von sechs Stunden wurde die steigende Fluoreszenz aufgrund steigender Menge an umgesetztem Modellsubstrat gemessen. Die Versuchstemperatur betrug 25°C. Die Messungen fanden kontinuierlich alle 60 Minuten statt. In allen natürlichen Wasserproben war linearer Substratumsatz nachzuweisen. Lediglich in der Leitungswasserprobe konnte für Glucosidase und Phosphatase keinerlei Enzymaktivität festgestellt werden. Besonders interessant waren Proben mit niedrigen Aktivitäten, so die Tiefbrunnen in Schlitz und Fulda, das Uferfiltrat der Schlitz und das Quellwasser des Breitenbaches. Die Substratumsatzraten lagen für MUF-Glc zwischen 1,1 und 291 nmol l⁻¹ h⁻¹. Phosphatase zeigte höhere Aktivitäten zwischen 9,2 und 320 nmol l⁻¹ h⁻¹. Leucin-Aminopeptidase wurde nur in den Proben in Schlitz untersucht. Die Substratumsätze ergaben Werte zwischen 5,81 und 1560 nmol l⁻¹ h⁻¹. Selbst in der Leitungswasserprobe war eindeutig Substratumsatz nachzuweisen. Mit der vorliegenden Methode lassen sich sehr niedrige Enzymaktivitäten bis zu etwa 1 nmol l⁻¹ h⁻¹ nachweisen. Ob es allerdings Wasserproben mit geringeren Aktivitäten gibt, die sich noch einwandfrei bestimmen lassen, muß offenbleiben. Die Methode sollte jedoch in einem Punkt abgeändert werden: der Kochvorgang, der zur Degenerierung der Enzyme in der Probe dient, übt einen entscheidenden Einfluß auf die Fluoreszenz in der Probe aus. Durch die Hitze werden MUF-Substrate gespalten. Dies führt zu einer nicht gewollten Erhöhung der Fluoreszenz insbesondere bei Verwendung von MUF-P und beeinflußt generell bei Proben niedriger Aktivität die Meßwerte. Dieser Vorgang sollte entfallen, wenn eine unverzügliche Messung der Proben nach Entnahme aus dem Reaktionsgefäß gewährleistet ist.
Die vorliegende Arbeit zeigt, daß sich fluorigene Modellsubstrate gut zur schnellen, sicheren, sauberen und kostengünstigen Bestimmung extrazellulärer Enzymaktivitäten sehr niedriger Konzentrationen in natürlichen Wasserproben eignen. Da jedoch aufwendige Tests hinsichtlich Temperaturoptimum und Substratkonzentration notwendig sind, um die Methode an die jeweiligen Bedingungen der Wasserprobe anzupassen, sollte sie nur in wissenschaftlichen Versuchen zur Anwendung kommen. Eine Verwendung zu routinemäßigen Untersuchungen und Kontrollen von Grundwasser kommt nach dem derzeitigen Stand nicht in Frage.
